Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la souris
REMARQUE : La procédure suivante, y compris la préparation des animaux et la chirurgie, dure 30 à 40 min. Avant l’opération, allumez le microscope et réchauffez l’incubateur fourni sur le microscope à 37 °C.
- Réaliser des expériences sur des souris TcrdEGFP âgées de 8 à 10 semaines sur un fond C57BL/6, obtenues auprès de Bernard Malissen (INSERM, Paris, France). Selon la procédure approuvée par l’IACUC, anesthésier la souris par injection intraveineuse de kétamine (120 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) en fonction du poids de l’animal. Évaluez le niveau d’anesthésie en fonction de la fréquence respiratoire (55 à 65 respirations par minute), du pincement des orteils et du réflexe palpébral.
- Une fois l’anesthésie chirurgicale atteinte, fixez les pattes arrière de la souris à l’aide de ruban adhésif sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle, qui peut être surveillée par un thermomètre rectal. S’il y a des signes que l’anesthésie s’estompe (p. ex. augmentation du rythme respiratoire, clignement des yeux et/ou contraction des muscles oculaires en réponse au réflexe palpébral), réadministrez 50 μL de kétamine/xylazine à la fois jusqu’à ce que la souris soit complètement sédative.
- Préparez le colorant nucléaire en diluant 50 μL de Hoechst 33342 (10 mg/mL) avec 315 μL de solution saline à 0,9 %; la concentration finale est de 37,5 mg/kg en fonction du poids de la souris (volume approximatif de 200 μL). Une fois la souris anesthésiée, injectez lentement le Hoechst à l’aide d’une seringue à tuberculine à travers le sinus veineux rétro-orbitaire.
REMARQUE : Attendez 1 à 2 minutes avant de passer à l’étape suivante pour permettre à la souris de s’acclimater au changement de volume circulant après l’injection rétro-orbitaire.
- Placez une petite quantité de lubrifiant sur les yeux pour éviter qu’ils ne se dessèchent.
2. Chirurgie de la souris : laparotomie pour exposer la muqueuse intestinale
- Faites une incision verticale de 2 cm à travers la peau et le péritoine le long de la ligne médiane du bas-ventre pour extérioriser la région de l’intestin à imager.
- À l’aide d’une pince coudée, retirez délicatement le caecum de la cavité péritonéale et identifiez la zone de l’intestin grêle à imager. Veillez à ne pas déchirer les vaisseaux sanguins mésentériques pendant ce processus. Pour minimiser les dommages ou les saignements potentiels, évitez de saisir ou de pincer l’intestin avec des pinces.
- Localisez une région appropriée de l’intestin grêle (2 à 3 cm) pour l’imagerie qui contient un minimum de contenu fécal. Remettez soigneusement le caecum et le reste de l’intestin grêle dans la cavité péritonéale, tout en laissant le segment d’intérêt exoritéré.
REMARQUE : Évitez de percer le cæcum ou de perturber le système vasculaire mésentérique pendant cette étape.
- Placez deux paires de pinces de chaque côté du mésentère sous-jacent entre les vaisseaux sanguins et frottez doucement les extrémités des pinces ensemble pour créer un trou dans la membrane (Figure 1). Cela permettra à l’aiguille de passer à travers le mésentère lors de la fermeture de la cavité péritonéale sous l’intestin.
- Fermez l’incision tout en gardant l’anse de l’intestin extériorisée. À l’aide d’une pince coudée et d’une aiguille incurvée à pointe effilée fixée à une suture de 5 cm, pénétrez d’un côté du péritoine, passez par le trou fait à l’étape précédente et remontez par l’autre côté de la muqueuse péritonéale. Placez une suture en haut et une autre près du bas de l’incision.
REMARQUE : Évitez d’endommager le système vasculaire pendant cette étape.
- Répétez ce processus pour fermer la peau sous l’anse intestinale, en plaçant une suture au milieu de l’incision, entre les sutures précédentes dans le péritoine sous-jacent.
REMARQUE : Il est important de n’extérioriser que la zone à imager ; Cela réduira les mouvements parasites pendant l’imagerie. Assurez-vous d’éviter d’attacher les artères mésentériques.
- Utilisez un électrocautérisation pour faire une ligne de perforation le long de la bordure anti-mésentérique. Immédiatement après la cautérisation, appliquez quelques gouttes d’eau à la surface de l’intestin pour éviter d’endommager davantage les tissus induits par la chaleur. Épongez avec un Kimwipe pour éliminer l’eau résiduelle.
- Découpez une petite fente horizontale sur le bord distal du tissu cautérisé à l’aide de ciseaux Vannas et procédez à la coupe le long de la ligne cautérisée vers l’extrémité proximale du segment de tissu extérisé (environ 1,5 cm de longueur) pour exposer la surface de la muqueuse.
REMARQUE : Si nécessaire, utilisez une pince pour retirer délicatement tout excès de contenu fécal restant sur la surface de la muqueuse exposée.
- Couvrez l’abdomen de la souris avec un Kimwipe humide pour éviter que les tissus ne se déshydratent. Transportez la souris au microscope dans un récipient couvert.
3. Acquisition d’images par microscopie confocale à disque rotatif
- Pipette 150 μL d’AlexaFluor 633 1 μM en HBSS sur le fond en verre d’un plat de 35 mm. Positionnez la souris de manière à ce que la surface muqueuse ouverte entre directement en contact avec la lamelle.
- Inclinez la tête du microscope vers l’arrière et placez la souris sur la parabole sur la platine d’imagerie dans un incubateur préchauffé. Vous pouvez également couvrir la souris avec une couverture chauffante pour maintenir la température corporelle.
- Lancez le logiciel d’imagerie. L’intensité d’excitation et le temps d’exposition de chaque laser ne doivent pas dépasser 10-15 mW ou 120-150 ms, respectivement, afin d’éviter le photoblanchiment et de minimiser l’intervalle entre les points temporels. Réglez la moyenne d’image sur « 2 » et activez la fonction de gain EM pour réduire le bruit de fond. Sélectionnez l’étalonnage de l’objectif 63x pour garantir la mesure correcte de la taille des pixels.
REMARQUE : Les paramètres détaillés ci-dessus sont destinés à fournir une référence initiale, mais varient en fonction des configurations de microscope individuelles.
- À l’aide du laser de 405 nm et de l’objectif aérien 20x, visualisez les noyaux pour localiser un champ de villosités qui manquent de mouvement notable ou qui dérivent à l’œil nu. Évitez les zones de mouvements artificiels dus à la respiration, au péristaltisme ou au rythme cardiaque.
- À l’aide du balayage XY, enregistrez la coordonnée XY du champ d’intérêt et passez à l’objectif d’immersion glycérol 63X.
- Vérifiez que les villosités dans le champ sélectionné sont stables en acquérant une image en direct sur le canal 405 nm pendant 1 min maximum.
- Lors de l’acquisition d’une image en direct sur le canal 405 nm, ajustez la mise au point pour trouver le plan orthogonal juste en dessous de la pointe villeuse. Acquérez des empilements Z en commençant juste en dessous de l’épithélium de l’extrémité des villosités jusqu’à ce qu’il soit difficile de résoudre les noyaux, environ 15 à 20 μm, en utilisant un pas de 1,5 μm.
REMARQUE : Lors de l’imagerie avec trois canaux (405, 488, 640 nm) en utilisant les temps d’exposition décrits ci-dessus, il est possible d’acquérir les trois canaux séquentiellement à des intervalles d’environ 20 s.
- Ouvrez le logiciel en mode analyse, 3 à 5 minutes après le début de l’acquisition, pour confirmer la stabilité de l’image et la motilité γδ IEL. Continuez à acquérir des images pendant 30 à 60 minutes pour chaque champ de villosités. Enregistrez 2 à 3 champs pour chaque souris. Pendant l’imagerie, surveillez la souris toutes les 5 minutes.
