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1. Production et caractérisation des LMP
REMARQUE : Pour éviter toute contamination, assurez-vous que tous les matériaux utilisés dans cette expérience sont stériles ou autoclavés. Effectuer toutes les étapes de la RT dans une enceinte de sécurité biologique dans des conditions stériles, sauf indication contraire.
- Stimulation et collecte de parlementaires
- Décongelez une aliquote de 10 millions de cellules T CEM dans un bain d’eau à 37 °C. Diluer dans 10 ml de milieu hématopoïétique sans sérum préchauffé tel que X-VIVO, dans un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 200 g x 5 min. Aspirez le surnageant et mettez les cellules en suspension dans un milieu préchauffé de 5 ml.
- Transvaser les cellules dans un flacon de culture tissulaire T75 (pour les cellules en suspension) avec 15 ml de milieu hématopoïétique préchauffé tel que X-VIVO et incuber pendant 4 jours dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Après 4 jours, transférez tout le milieu de culture et les cellules dans un flacon de culture tissulaire T175 contenant 100 ml de milieu frais. Continuez à incuber les cellules pendant environ 72 heures dans les mêmes conditions jusqu’à ce qu’elles aient atteint une densité de 2 millions de cellules/ml.
- Répartissez uniformément les cellules entre quatre fioles T175 contenant chacune 150 ml de milieu frais et poursuivez la culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules aient grandi (environ 48 heures d’incubation) jusqu’à une densité de 2 millions/ml.
- Prélever les cellules de chaque fiole par centrifugation à 200 x g pendant 5 min et remettre en suspension 300 x 106 cellules dans une nouvelle fiole T175 contenant 150 ml de milieu frais, afin de maintenir la densité cellulaire de 2 millions/ml.
- Ajouter l’actinomycine D (dissoute dans du DMSO à 2 mg/ml) dans le milieu à une concentration finale de 0,5 μg/ml et incuber pendant 24 heures.
- Transvasez tout le milieu de culture dans des tubes coniques de 50 ml et faites tourner les cellules à 750 x g pendant 5 min. Transférez le surnageant dans des tubes coniques de 50 ml et centrifugez à 1 500 x g pendant 15 min pour éliminer les gros fragments de cellules.
- Transvasez le surnageant dans un flacon de 250 ml et ultracentrifugez-le à 12 000 x g pendant 50 min. Jetez le surnageant et récupérez les granulés.
- Laver les granulés enrichis en LMP avec 40 ml de PBS stérile dans un tube de 50 ml par centrifugation à 12 000 x g pendant 50 min. Répétez cette étape deux fois.
- Récupérez le dernier surnageant de lavage, il sera utilisé comme contrôle du véhicule. Mettez les pastilles LMP en suspension dans 1 ml de PBS et transférez-les dans un microtube stérile de 1,5 ml. Aliquote et entreposer les PMT isolés à -80 °C (pour éviter plusieurs cycles de décongélation libre).