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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Enrichir les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène avec des cellules présentatrices d’antigène artificielles à nanoparticules préparées.
- Isolez les lymphocytes T CD8+.
- Euthanasier les animaux en les exposant à l’isoflurane suivi d’une luxation du col de l’utérus.
- Retirez la rate et les ganglions lymphatiques des souris C57BL/6j de type sauvage et placez-les dans une solution de PBS. Faites macérer les organes et éluez les cellules à travers une passoire cellulaire stérile de 70 μm avec des lavages fréquents de PBS.
- Pour éliminer les lymphocytes T non CD8+, utilisez un kit d'isolement des lymphocytes T CD8+ sans contact et suivez les instructions du fabricant.
REMARQUE : Chaque condition antigénique nécessite au moins 3 x 106 lymphocytes T CD8+.
- Ajoutez les aAPC nanoparticulaires à lier aux lymphocytes T CD8+.
- Après l’isolement, concentrer à un volume de 100 μL dans du PBS avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’EDTA.
- Déterminez le nombre d’aAPCs à ajouter en calculant en fonction du rapport de 1011 11 ligatures CMH-Ig liées à l’aAPC et chargées en peptides pour 106 lymphocytes T CD8+.
- Incuber des particules d’aAPC et des lymphocytes T CD8+ pendant 1 h à 4 °C avec mélange continu dans un tube stérile à fond rond en polystyrène de 5 ml.
- Préparez un milieu supplémenté et un facteur de croissance des lymphocytes T (TCGF) pour éluer et cultiver les lymphocytes T CD8+.
- Pour les milieux supplémentés, complétez le milieu RPMI 1640 complet (avec de la glutamine) avec 1 x acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,4 fois une solution vitaminique, 92 μM de 2-mercaptoéthanol, 10 μM de ciprofloxacine et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS).
- Pour faire TCGF, suivez les protocoles établis.
note: TCGF est un cocktail interne de cytokines immunitaires humaines qui est essentiel pour fournir aux lymphocytes T des signaux de stimulation supplémentaires nécessaires à la croissance. TCGF pourrait être échangé contre des cytokines stimulatrices de lymphocytes T connues telles que l’IL-2, l’IL-7 ou l’IL-15 ; cependant, chacun peut polariser la réponse des lymphocytes T en conséquence.
- Laver et enrichir un mélange de lymphocytes T aAPC et CD8+.
- Laver les aAPC de particules magnétiques, d’abord à l’aide du tampon PBS avec 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA, puis à l’aide d’un milieu supplémenté et enfin à l’aide d’un milieu supplémenté avec 1 % de TCGF.
- Éluer les aAPCs et les lymphocytes T CD8+ enrichis dans 500 μL de milieux supplémentés avec 1 % de TCGF.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’une plaque dans une plaque à fond en U de 96 μL dans 160 μL par puits de milieu supplémenté avec 1 % de TCGF à une concentration de 2,5 x 105 lymphocytes T CD8+/mL.
- Si vous isolez à l’aide d’aAPCs avec uniquement des Ig-MHC chargées de peptides à la surface (aucun signal de co-stimulation), effectuez l’étape 4.5. Si vous isolez à l’aide d’aAPCs avec à la fois des signaux MHC-Ig chargés en peptides à la surface et des signaux co-stimulateurs, passez à l’étape 5.
- Ajoutez les particules magnétiques recouvertes de signaux de co-stimulation à la surface à la fraction enrichie et ajoutez un champ magnétique pour co-regrouper les signaux de stimulation à la surface des cellules T.
- Aux fractions enrichies, ajoutez un anticorps stimulateur équimolaire (ou supérieur selon l’application - voir la section sur les propriétés aAPC à contrôler) au nombre d’Ig-CMH chargées en peptides sur la particule.
- Laisser les particules magnétiques co-stimulatrices se lier aux lymphocytes T CD8+ enrichis pendant 1 h à 4 °C.
- Ajoutez un champ magnétique en plaçant la plaque de culture entre deux disques magnétiques en néodyme N52 de 1,9 cm (0,75 pouce) de longueur.
note: Les disques magnétiques N52 ont un champ extrêmement puissant. Il faut prendre soin de les stocker à l’aide d’entretoises entre les aimants, car il est difficile de les séparer l’un de l’autre lorsque vous les placez sur les plaques de culture. Pour empêcher les aimants de coller aux composants métalliques de l’incubateur, placez-les dans des contenants en polystyrène coniques de 50 ml en bas et en haut.
2. Développer et détecter les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène avec des cellules présentatrices d’antigène artificielles à nanoparticules préparées
- Ajoutez la plaque à puits à fond en U 96 avec les aAPCs et les lymphocytes T CD8+ dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2, 37 °C pendant 3 jours. Le jour 3, nourrissez les cellules avec 80 μL par puits de milieu supplémenté avec 2 % de TCGF et remettez-les dans l’incubateur jusqu’au jour 7.
- Le 7e jour, récoltez les cellules stimulées dans un tube à fond rond de 5 ml pour les compter.
- Une fois que toute la solution est récoltée, faites tourner les cellules récoltées pour les remettre en suspension dans 0,5 mL de PBS avec 0,05 % d’azoture de sodium et 2 % de FBS. Comptez les cellules viables par coloration au bleu trypan et comptage sur un hémocytomètre.
- Retirez 50 000 à 500 000 cellules comptées dans deux nouveaux tubes à fond rond de 5 ml pour une coloration spécifique de l’antigène. Un tube sera utilisé pour la coloration peptide-CMH apparentée, et l’autre tube sera utilisé pour la coloration non apparentée afin de déterminer la coloration de fond.
- Ajouter 1 μg d’IG-CMH biotinylée dans les tubes apparentés et non apparentés respectifs dans 100 μL de PBS avec 0,05 % d’azoture de sodium et 2 % de FBS avec CD8a de souris conjugué à l’allophycocyanine (APC), clone 53-6,7 (rapport de dilution de 1:100) pendant 1 h à 4 °C.
- Ajoutez de la streptavidine secondaire et des taches mortes vivantes. Éliminer l’excès de CMH-Ig biotinylée avec du PBS par centrifugation. Ensuite, colorez tous les échantillons avec un rapport de 1:350 de streptavidine marquée à la phycoérythrine (PE) et un rapport de 1:1000 d’une coloration verte à cellules mortes fixable vivante/morte pendant 15 min à 4 °C.
- Lire tous les échantillons sur un cytomètre en flux pour déterminer la spécificité et le nombre de cellules spécifiques de l’antigène.
- Laver les taches secondaires et les taches vivantes/mortes en excès par centrifugation et remettre en suspension avec 150 μL de tampon PBS avec 0,05 % d’azoture de sodium et 2 % de FBS à lire sur un cytomètre en flux.
- Déterminez le nombre et le pourcentage de cellules spécifiques à l’antigène à l’aide d’un logiciel d’analyse de données.
- Pour déterminer le pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène, utilisez les portes suivantes dans l’ordre respectif live+, lymphocyte+ (diffusion directe par diffusion latérale), CD8+ et Dimère+. Déterminez la porte Dimer+ en comparant la coloration non apparentée à la coloration apparentée.
- Déterminez le pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène dans un échantillon en soustrayant le pourcentage de Dimère+ de la coloration CMH-Ig apparentée de la coloration CMH-Ig non apparentée.
- À l’aide de ce pourcentage de cellules spécifiques de l’antigène, multipliez-le par le nombre de cellules comptées, ce qui donne le nombre de cellules spécifiques de l’antigène résultant de l’enrichissement et de l’expansion.
note: Une compensation devra être mise en place sur le cytomètre en flux puisqu’il y a chevauchement spectral avec les fluorophores utilisés dans ce panneau.