Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement de la PMC par lavage intrapéritonéal
- Avant l’isolement de la cellule, préparez les matériaux énumérés au tableau 1.
- Utilisez des souris mâles âgées de 8 à 14 semaines pour l’isolement de la PMC. Euthanasier une souris par inhalation de CO2, et confirmer la mort par perte de réflexes. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 % et fixez-la sur un bloc de mousse à l’aide d’épingles (côté dorsal vers le bas). Retirez la peau ventrale de la souris à l’aide de ciseaux à bord émoussé. Évitez d’endommager la cavité péritonéale.
note: Nous utilisons généralement ce protocole pour les souris ayant un patrimoine génétique de souche C57BL/6N.
- Injecter 7 ml de milieu glacé RPMI et 5 ml d’air dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille de 27 g. Enfoncez soigneusement l’aiguille dans le péritoine et ne perforez aucun organe. Utilisez un endroit dans la région de la graisse épididymaire pour réduire le risque de perforation d’organe.
- Après l’injection, secouez la souris pendant 1 minute pour détacher les cellules péritonéales dans le milieu RPMI. Ne secouez pas trop fort la souris, pour éviter d’endommager les organes internes et de contaminer la cavité péritonéale avec le sang.
- Réutilisez la seringue de 10 ml en l’équipant d’une nouvelle canule de 20 G. Déplacez les organes internes d’un côté en inclinant le bloc de mousse et en le tapotant doucement sur le banc pour faciliter l’aspiration moyenne de l’autre côté. Insérez une aiguille de 20 G, biseautez vers le haut et aspirez le liquide de l’abdomen doucement et lentement (~0,5 mL/s) pour éviter l’obstruction par les organes internes. Prélevez autant de liquide que possible (généralement 5 à 6 ml).
- Retirez l’aiguille de la seringue et transférez la suspension cellulaire recueillie dans un tube de collecte sur de la glace. Jetez un tube d’échantillon s’il y a une contamination sanguine visible.
- Centrifuger les tubes avec la suspension cellulaire à ~300 x g pendant 5 min. Sous une hotte stérile, aspirez le surnageant. Pour chaque souris, mélanger les granules d’échantillon dans 4 mL de milieu PMC froid (4 à 10 °C) et transférer la suspension cellulaire dans une fiole deculture de 25 cm 2. Ajouter les facteurs de croissance IL-3 et SCF aux concentrations finales de 10 ng/mL et 30 ng/mL, respectivement. Placez le ballon contenant les cellules dans un incubateur (37 °C et 5 % CO2) et incubez pendant ~48 h jusqu’à la procédure suivante.
Tableau 1 : Matériaux pour l’étape 1.
| 1 | glace |
| deux | Seringues de 10 mL |
| 3 | Aiguilles de 27 g |
| 4 | Aiguilles de 20 g |
| 5 | Bloc et goupilles en polystyrène |
| 6 | Tubes de prélèvement (tubes à centrifuger en plastique de 50 ml) |
| 7 | 70 % d’éthanol |
| 8 | RPMI Medium (pré-réfrigéré et conservé sur glace) |
| 9 | PMC Medium : RPMI Medium + 20 % de FCS (sérum de veau fœtal) + 1 % de solution de pénicilline streptomycine (Pen-Strep) |
| 10 | Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco - DPBS (sans Ca2+ et Mg2+) |
| 11 | Flacons de culture (25 cm) |
| 12 | Solutions mères de facteurs de croissance (IL-3 : 1 μg/μL ; SCF : 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipettes sérologiques (10 mL) |
| 14 | Pointes de pipettes stériles (20–200 μL) |
| 15 | Hémocytomètre |
| 16 | Centrifugeuse de banc |
| 17 | Ciseaux et pinces |
| 18 | Chambre CO2 pour souris |
| 19 | Capot stérile ouvert |
| 20 | Capot stérile fermé |
| 21 | Incubateur cellulaire (37 °C et 5 % CO2) |
| 22 | Pipettes de transfert (20 à 200 μL) |