Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Fabrication de dispositifs et lithographie douce
REMARQUE : Des techniques standard de lithographie douce ont été utilisées pour créer le microcanal polydiméthylsiloxane (PDMS).
- Mélangez le précurseur PDMS dans un rapport de 10:1 entre la base et l’agent de durcissement.
- Versez 30 g du mélange de précurseurs PDMS dans le moule en aluminium micro-usiné (voir la figure 1 pour les dimensions) et 20 g du mélange de précurseurs PDMS dans la boîte de Pétri de 100 mm.
note: La boîte de Pétri est utilisée pour fabriquer le film épais de PDMS (~3 mm) pour la couche de support. La couche de support du PDMS fournit des propriétés de surface physiques uniformes dans toute la microfluidique. Alternativement, un mince film PDMS sur la lame de verre peut être utilisé. Le moule maître avec des dimensions de canal spécifiques a été conçu et fabriqué par micro-fraisage sur la tôle d’aluminium. Le canal en spirale utilisé dans cette étude était un microcanal en spirale à 8 boucles avec une entrée et deux sorties, le rayon augmentant de 8 mm à 24 mm pour une séparation efficace basée sur la taille.
- Placez le moule et la boîte de Pétri dans un dessiccateur sous vide pour dégazer jusqu’à ce qu’aucune bulle ne soit visible à la surface, généralement 5 à 10 min. Utilisez un aspirateur domestique pour le dessiccateur.
- Relâchez le vide et placez le moule et la boîte de Pétri dans un four à 90 °C pendant 1 h
note: Une plaque chauffante ou d’autres outils chauffants peuvent être utilisés à la place d’un four.
- Sortez le moule et la boîte de Pétri du four et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 10 min.
- Découpez soigneusement le contour et percez les trous d’accès au fluide sur l’appareil à l’aide d’un perforateur de 2 mm.
note: La taille du poinçon peut varier en fonction de la taille du tube ou du guide de fluide.
- Collez un ruban adhésif sur le côté canal de l’appareil et un film épais de PDMS, et décollez soigneusement avec une pince pour enlever la poussière.
- Traitez à la fois le côté canal de l’appareil et le PDMS simple avec du plasma d’air et liez-le avec la couche de support préparée de PDMS simple (Figure 1A).
- Placez la puce sur la lame de verre de 50 mm x 70 mm et placez-la dans un four à 70 °C pendant au moins 30 minutes pour améliorer la force d’adhérence.
2. Collecte de sécrétions trachéales chez des patients sous ventilation mécanique
REMARQUE : Les sécrétions trachéales peuvent être obtenues à partir de patients sous ventilation mécanique lors de soins respiratoires de routine normaux en utilisant un protocole modifié par rapport aux méthodes conventionnelles pour s’adapter au patient adulte standard ventilé. Les échantillons ont été anonymisés et envoyés immédiatement pour traitement.
- Si une aspiration trachéale est indiquée, utilisez un cathéter pour extraire les sécrétions des voies respiratoires.
- Avancez le cathéter avec précaution à mi-chemin dans la sonde endotrachéale et instillez 5 ml de solution saline normale stérile à 0,9 % à partir d’une seringue préremplie de 10 ml.
- Lorsque le cathéter est complètement avancé ou que la résistance est rencontrée, aspirez les sécrétions et collectez-les dans un récipient stérile de collecte d’expectorations.
- Prélever 10 ml de sécrétions trachéales dans un contenant d’expectoration stérile et le placer sur de la glace. Envoyez immédiatement les échantillons pour traitement.
3. Préparation de l’échantillon de sécrétion trachéale
REMARQUE : Toutes les expériences doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité avec l’équipement de protection individuelle approprié.
- Dispersez 1 mL d’échantillons de sécrétions des voies respiratoires dans 9 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une seringue en plastique de 10 mL (pour une dilution de 10x). Utilisez une pipette émoussée pour homogénéiser l’échantillon de mucus.
- Filtrez le diluant avec une crépine à cellules en nylon de 40 μm pour éliminer les gros morceaux ou les caillots sanguins, qui peuvent bloquer le trou d’accès à la microfluidique ou le canal. Placez l’échantillon sur la glace après le traitement.
- Dispersez le diluant de chaque échantillon à l’aide d’un volume de 100 fois de tampon PBS, ce qui donne une suspension diluée de 1 000 fois. Placez l’échantillon sur la glace pendant toute l’opération de dissociation.
4. Configuration expérimentale
REMARQUE : Toutes les expériences doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité avec l’équipement de protection individuelle approprié.
- Assemblez la puce PDMS avec le guide de fluide pour appliquer un écoulement uniforme à chacun des quatre microcanaux en spirale (Figure 1B).
note: Quatre canaux ont été utilisés pour augmenter le débit par parallélisation, ainsi que pour optimiser le volume et la densité cellulaire de la suspension résultante. Le guide de fluide est conçu et fabriqué avec une imprimante 3D de type stéréolithographie avec de la résine transparente. L’orifice d’entrée et de sortie du guide de fluide utilise des connecteurs Luer femelles pour faciliter le raccordement et assurer une étanchéité stable pendant le fonctionnement.
- Connectez un connecteur Luer mâle de 1/16 pouce à l’entrée, à la sortie de la paroi intérieure (IW) et à l’orifice de sortie de la paroi extérieure (OW) du guide de fluide et connectez un tube en silicone à la suspension de l’échantillon.
- Insérez des pointes émoussées à chaque extrémité de l’entrée et de la sortie pour atteindre le fond du réservoir d’échantillon.
- Connectez la pompe péristaltique à la tubulure d’entrée.
- Placez l’extrémité du tube d’entrée et du tube de sortie DI dans le réservoir d’échantillonnage, puis placez l’extrémité du tube de sortie OW dans le réservoir à déchets (figures 1C et D).
- Placez le tube de 50 ml de PBS filtré sans calcium ni magnésium dans le réservoir d’échantillon.
- Démarrer le pompage à un faible débit (~1 mL/min) pour amorcer l’appareil.
note: Lorsque des bulles sont capturées dans le canal, poussez le haut du canal avec la pince à épiler pour déstabiliser et éliminer les bulles d’air. Lorsque l’appareil est complètement rempli de solution tampon, changez le tube PBS pour préparer le tube d’échantillon de sécrétion des voies respiratoires.
- Lorsque l’échantillon est placé dans le réservoir d’échantillons, mettre en marche la pompe péristaltique et régler le débit à 4 mL/min (figures 1C, D).
- Lorsque le volume de l’échantillon atteint le volume désigné (~1 mL), arrêtez l’opération et débranchez la tubulure en silicone.
note: La méthode proposée est plus efficace pour réduire un grand volume de diluant (>50 mL) en un volume de microtube à centrifuger (~1 mL) (figure 2).
