Marquage des lymphocytes T auxiliaires murins à l’aide d’anticorps monoclonaux radiomarqués

Résumé

Source : Hoffmann, S. H. L., et al., Marquage des lymphocytes murins par ⁶⁴récepteurs d’anticorps Cu ciblant le trafic cellulaire in vivo par PET/CT. J. Vis. Exp. (2017)

Dans cette vidéo, nous démontrons le radiomarquage intracellulaire des cellules T auxiliaires à l’aide d’anticorps monoclonaux conjugués aux isotopes radioactifs pour l’imagerie non invasive par tomographie par émission de positons.

Protocole

1. Radiomarquage des cellules cOVA-TH1

REMARQUE : Les ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb seront appliqués sur des cellules cOVA-TH1 cultivées pour permettre le marquage radioactif intracellulaire.

1. Pour le radiomarquage des cellules cOVA-TH1, prélevez 37 MBq des ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarqués dans une seringue sans volume mort à l’aide d’un calibrateur de dose. Ajouter 1 mL de solution saline pour obtenir une solution de 37 MBq/mL.
2. Mettre en suspension les cellules cOVA-TH1 dans le milieu à raison de 2 x 10⁶ cellules/mL et ajouter 0,5 mL de suspension cellulaire dans chaque puits dans une plaque de 48 puits.
3. Ajouter 20 μL de la solution 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb de ³⁷MBq/mL fraîchement préparée dans chaque puits de la plaque à 48 puits. Le rapport final pour le marquage est de 0,7 MBq pour 10⁶ cellules dans un volume de 520 μL. Incuber à 37 °C et 7,5 % de CO₂ pendant 30 min.
4. Après l’incubation, remettre soigneusement les cellules en suspension dans chaque puits et transférer la suspension cellulaire de la plaque à 48 puits dans un tube à bouchon à vis de 50 ml. Pour minimiser la perte de cellules, rincez chaque puits avec un milieu préchauffé.
5. Centrifugez la suspension de cellules cOVA-TH1 à 400 x g pendant 5 min, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 ml de PBS préchauffé. Retirer une aliquote de la suspension cellulaire pour le comptage cellulaire. Répétez l’étape de lavage.
6. Compter les cellules cOVA-TH1 viables dans une dilution appropriée avec coloration au bleu de trypan.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Module de travail 64Cu	WKL	Sur mesure	Production de 64Cu
Calibrateur de dose	Capintec	CRC-25R
Cyclotron PETtrace	Systèmes médicaux General Electric
DOTA-NHS	Macrocycliques	B-280
Anticorps anti-cOVA-TCR (KJ1-26)		Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridome	Conjugaison DOTA
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Référence 71633	Conjugaison DOTA
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	Réf. C7901	Conjugaison DOTA
Unité de filtration Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910008	Conjugaison DOTA
Eau ultrapure Rotipuran	Carl Roth	HN68.3	Conjugaison DOTA
Acétate d’ammonium	Sigma-Aldrich	Référence 32301	Conjugaison DOTA
Pbs	Université de Tübingen		Conjugaison DOTA
Colonne Micro Bio-spin P-6	Laboratoires Bio-Rad	7326221	Conjugaison DOTA
Citrate de sodium	Sigma-Aldrich	Référence 71497	Conjugaison DOTA
Cyclone Plus PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	Conjugaison DOTA
DMEM	Merck Millipore	102568	Ingrédient pour milieu cellulaire T
Fcs	Merck Millipore	S0115/1004B	Ingrédient pour milieu cellulaire T
Pyruvate de sodium	Merck Millipore	L0473	Ingrédient pour milieu cellulaire T
Acides aminés MEM	Merck Millipore	N° K0293	Ingrédient pour milieu cellulaire T
HEPES	Merck Millipore	L 1613	Ingrédient pour milieu cellulaire T
Pénicilline/streptomycine	Merck Millipore	A2212	Ingrédient pour milieu cellulaire T
0,05 mM de 2-β-mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M3148	Ingrédient pour milieu cellulaire T
Souris DO11.10		Élevage en interne	Culture cellulaire TH1
Le	Gibco	14190144	Culture cellulaire TH1
Filtre à cellules 40 μm	Corning	Référence 352340	Culture cellulaire TH1
Tampon de lysage ACK	Lonza	10-548E	Culture cellulaire TH1
CD4 MicroBeads, souris	Miltenyi Biotech	Tél. : 130-097-145	Culture cellulaire TH1
Séparateur QuadroMACS	Miltenyi Biotech	Tél. : 130-090-976	Culture cellulaire TH1
Colonne LS	Miltenyi Biotech	Tél. : 130-042-401	Culture cellulaire TH1
Anticorps anti-CD4 (Gk1.5)		Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridome	Culture cellulaire TH1
Anticorps anti-CD8 (5367.2)		Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridome	Culture cellulaire TH1
Anticorps anti-rat (MAR18.5)		Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridome	Culture cellulaire TH1
Complément lapin MA	tebu-Bio	Référence CL3221	Culture cellulaire TH1
Anticorps anti-IL-4 (11B11)		Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridome	Culture cellulaire TH1
peptide cOVA 323-339	Micro-collections EMC	Commande personnalisée	Culture cellulaire TH1
CPG1668-oligonucléotides	Eurofins MWG Operon	Commande personnalisée	Culture cellulaire TH1
L’IL-2	Novartis	Référence 65483-116-07	Culture cellulaire TH1
Plaques à 96 puits	Greiner	Référence 655180	Culture cellulaire TH1
Plaques à 24 puits	Greiner	Référence 662160	Culture cellulaire TH1
Fiole de culture cellulaire	Greiner	660175	Culture cellulaire TH1
Plaques à 48 puits	Greiner	677 180	Étiquetage des cellules
Gammacell 1000	Meilleurs Theratronics	Par enquête
Gulmay RT225	Gulmay	Par enquête
Trypan bleu	Merck Millipore	L6323	Évaluation in vitro