Une technique in vitro pour différencier les cellules T auxiliaires productrices de GM-CSF des cellules T naïves

Résumé

Source : Lu, Y., et al. Différenciation in vitro des cellules T Helper (T_HGM) productrices de granulocytes-macrophages-colonies-stimulant les colonies (GM-CSF) de souris.J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo démontre la différenciation in vitro des cellules T auxiliaires productrices de granulocytes-macrophages-facteurs de stimulation des colonies ou de cellules T auxiliaires productrices de GM-CSF (T_HGM). Les lymphocytes T naïfs isolés sont stimulés pour la différenciation en T_HGM, ce qui est confirmé par la détection d’une production intracellulaire élevée de GM-CSF et d’une faible expression d’autres cytokines spécifiques des lymphocytes T auxiliaires.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des réactifs et des matériaux

1. Préparer 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
   note: Gardez le tampon sur de la glace tout au long de la procédure pour des résultats optimaux.
2. Préparez 50 ml de milieu RPMI complet contenant du RPMI 1640, 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Utilisez un milieu RPMI complet contenant 50 μM de β-mercaptoéthanol pour la différenciation des cellules T_HGM. Ajoutez le β-mercaptoéthanol dans une hotte.
3. Préparer 7,5 mL d’un mélange d’anticorps anti-CD3e en diluant une substance concentrée anti-CD3e à 3 μg/mL dans du PBS. Enduire les plaques à 48 puits en ajoutant 150 μL du mélange d’anticorps dans chaque puits et incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h, ou à 4 °C pendant la nuit.
4. Stérilisez une paire de ciseaux et de pinces et conservez-les dans de l’éthanol à 70 % entre les dissections.

2. Préparation des splénocytes murins

1. Euthanasier la souris (âgée de 6 à 8 semaines) à l’aide d’une asphyxie au CO₂ ou d’une luxation cervicale approuvée par l’établissement. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 % et montez-la sur un bloc de polystyrène sur son dos. Transférez la souris dans une enceinte de sécurité biologique pour procéder aux étapes suivantes.
2. Tenez la peau à l’aide d’une pince et coupez la peau sous la cage thoracique sur le côté gauche sur environ 4 cm, à l’aide d’une paire de ciseaux. Ouvrez le sac péritonéal pour exposer la rate et utilisez des pinces stériles pour extraire la rate.
3. Placez une crépine à cellules de 70 μm sur un tube de 50 mL et pré-mouillez-la avec 2 mL de tampon. Placez les rates sur la crépine cellulaire (2 à 3 rates pour une crépine cellulaire) et faites-les macérer à l’aide de l’extrémité d’un piston de seringue de 5 ml.
4. Rincez la crépine et le tube plusieurs fois avec 1 à 2 ml de tampon d’isolement cellulaire jusqu’à ce que toutes les cellules soient rincées dans le tube. Jeter la crépine cellulaire et centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
5. Remettre la pastille en suspension avec 5 mL de tampon de lyse à base d’ammonium-chlorure de potassium (ACK) froid (4 °C) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA ; pH 7,2–7,4) et les mélanger délicatement pendant 2 min. Ajouter 10 mL de média RPMI complet pour neutraliser le tampon ACK et centrifuger immédiatement les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant après la centrifugation.

3. Isolement des lymphocytes T CD4⁺ à l’aide de microbilles magnétiques CD4 et d’une colonne de séparation

cellulaire

1. Remettre la pastille de cellule en suspension dans 5 mL de tampon d’isolement cellulaire. Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre de pré-séparation (30 μm) dans un nouveau tube de 15 ml pour éliminer tous les débris.
2. Prélever 10 μL de suspension cellulaire et effectuer une dilution 10x en ajoutant 90 μL de tampon. Prélever 10 μL de suspension cellulaire diluée et les mélanger avec 10 μL de bleu de trypan pour le comptage cellulaire. Comptez les cellules dans un hémocytomètre pour déterminer le rendement en cellules viables.
3. Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
4. Remettre les cellules en suspension dans 90 μL de tampon pour 10⁷ cellules. Ajouter 10 μL de microbilles CD4 magnétiques par 10^{à 7} cellules. Incuber les cellules pendant 15 min à 4 °C. Pour des résultats optimaux, mélangez doucement la suspension cellulaire toutes les 5 minutes pendant l’incubation.
5. Pendant l’incubation des cellules, placez une colonne de séparation sur le support magnétique. Mouillez au préalable la colonne avec 2 mL de tampon.
6. À la fin de l’incubation de la cellule ou de la bille, laver les cellules avec 5 mL de tampon et les centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant.
7. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de tampon, chargez l’échantillon dans la colonne de séparation des cellules et laissez-le s’écouler. À l’aide d’un tube à centrifuger de 15 ml, recueillir la fraction de cellules CD4. Ajoutez 1 mL de tampon pour laver le réservoir avant qu’il ne soit sec. Répétez l’étape de lavage 2 fois.
8. Retirez la colonne de séparation des cellules du support magnétique et placez-la sur un nouveau tube à centrifuger de 15 ml. Ajoutez 2 ml de tampon d’isolement cellulaire dans la colonne de séparation cellulaire et appliquez fermement le piston pour forcer les cellules à sortir de la colonne.
9. Centrifuger la fraction à 350 x g pendant 5 min à 4 °C pour obtenir des cellules CD4⁺. Jetez le surnageant.

4. Purification des lymphocytes T CD4⁺ naïfs (CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi) par tri cellulaire activé par fluorescence et différenciation T_HGM

1. Remettre en suspension la pastille de cellules CD4⁺ obtenue dans 500 μL de tampon. Mélanger les cellules avec un mélange d’anticorps conjugués fluorescents contenant CD4-PerCp (2,8 μg/mL), CD44-APC (2,4 μg/mL), CD25-PE (2 μg/mL) et CD62L-FITC (10 μg/mL) (tableau 1). Incuber les cellules sur de la glace pendant 20 à 30 min, tout en les protégeant de la lumière.
   note: Les concentrations des anticorps ont été optimisées au préalable en laboratoire. Le nombre d’anticorps indiqué correspond aux cellules de 1 à 2 souris.
2. Après l’incubation, laver les cellules avec 5 mL de tampon et centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 °C.
3. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 500 μL de tampon. Filtrez à nouveau les cellules à l’aide d’un treillis en nylon.
4. Transférez la suspension cellulaire dans un tube FACS pour le tri des cellules. Pré-enduire les tubes FACS de collection avec 500 μL de tampon.
5. Obtenir une population de CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi (de lymphocytes T CD4⁺ naïfs) par tri FACS. Identifiez d’abord CD4⁺CD25^-, puis sélectionnez CD44^ouCD62L hi cellules de cette population.
6. Recueillez les fractions de lymphocytes T CD4⁺ naïfs dans un nouveau tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
7. Remettre en suspension les lymphocytes T CD4⁺ naïfs à une concentration de 106 cellules/mL dans un milieu RPMI complet contenant 50 μM de β-mercaptoéthanol.
8. Aspirer les anticorps anti-CD3e utilisés pour le prérevêtement dans la plaque à 48 puits. Ensemencer 0,25 million (250 μL) de cellules dans chaque puits avec de l’IL-7 (2 ng/mL), de l’anti-CD28 (1 μg/mL) et de l’anti-IFNγ (10 μg/mL) (tableau 1).
   note: Les concentrations de cytokines et d’anticorps ont été optimisées préalablement en laboratoire pour une différenciation cellulaire T_HGM.
9. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 3 jours. Ne changez pas de milieu pendant l’incubation.

5. Analyse des cellules M T_Hde souris générées in vitro

1. À l’aide d’un microscope, vérifiez la différenciation cellulaire 3 jours après la différenciation. Récoltez les cellules et centrifugez-les à 350 x g pendant 5 min à 4 °C. Lavez les cellules 2 fois avec un média RPMI complet.
   note: Les cellules différenciées sont plus grandes que les lymphocytes T CD4⁺ naïfs.
2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu RPMI complet. Prenez 10 μL de suspension cellulaire et mélangez-le bien avec 10 μL de bleu trypan pour déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Divisez les cellules différenciées en trois potions pour la restimulation et l’analyse.
   note: La coloration intracellulaire des cytokines nécessite ≥0,5 million de cellules.
3. Pour la coloration intracellulaire des cytokines, restimulez les cellules avec du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) (100 ng/mL) et de l’ionomycine (1 μg/mL) en présence d’un inhibiteur du transport des protéines (1 μL/mL) pendant 4 à 6 h.
   1. Prélever les cellules et les colorer avec un anticorps anti-CD4 (conjugué à la PerCP, 0,2 mg/mL, dilution 1:100 ; ou conjugué à la FITC, 0,5 mg/mL, dilution 1:100) pendant 30 min.
   2. Fixez les cellules avec 200 μL de tampon de fixation pendant 20 à 60 min. Après la fixation, laver les cellules 2x avec 1 mL de tampon de perméabilisation.
   3. Effectuer une coloration intracellulaire avec des anticorps contre le GM-CSF (conjugué au PE, 0,2 mg/mL, dilution 1:100), l’IL-17A (conjugué au FITC, 0,5 mg/mL, dilution 1:100 ; APC conjuguée, 0,2 mg/mL, dilution 1:100), IL-4 (APC conjuguée, 0,2 mg/mL, dilution 1:100) et IFNγ (APC conjuguée, 0,2 mg/mL, dilution 1:100 ; PE-conjugué, 0,2 mg/mL, dilution 1:100) pendant 30 min dans l’obscurité.

Tableau 1 : Cytokines et anticorps utilisés.

nom	Concentration des stocks	Concentration de travail	dilution	Volume dans un tampon de coloration de 500 μL
CD4-PerCp	0,2 mg/mL	2,8 μg/mL	1:71	7 μL
CD44-APC	0,2 mg/mL	2,4 μg/mL	1:83	6 μL
CD25-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100	5 μL
CD62L-FITC	0,5 mg/mL	10 μg/mL	1 h 50	10 μL
GM-CSF-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-17A-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
IL-17A-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-PE	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-4-APC	0,2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
CD4-FITC	0,5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
L’IL-7	20 μg/mL	2 ng/mL	1:10000
Anti-CD28	0,5 mg/mL	1 μg/mL	1/500
Anti-IFNγ	1 mg/mL	10 μg/mL	1:100

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640	Biowest	L0500-500
FBS inactivé par la chaleur	Capricorne	FBS-HI-12A
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140122
10 fois par PBS	1ère base	Réf. BUF-2040-10	Dilué à 1x PBS dans de l’eau stérile
Edta	1ère base	BUF-1053-100ml-pH8.0
Tampon ACK 10X	Biolégende	420301	dilué dans de l’eau stérile
Passoire cellulaire	SPL Sciences de la Vie	Référence 93070
Microbilles CD4	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-049-201
2-Mercaptoéthanol	sigma	Référence M7522
Colonne LS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-401
Support magnétique	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-042-303
Seringue de 1 ml	Terumo	SS+01T
centrifugeuse	Eppendorf	Eppendorf 5810R
Trieur de cellules Sony SY3200	Sony	Trieur de cellules Sony SY3200
Tube à centrifuger conique de 50 ml	Greiner Bio-One	210261
Tube de centrifugation conique de 15 m	Greiner Bio-One	188271
Tube FACS	Corning	352054
anti-souris CD4 PerCP-eFluor 710	eBiosciences	Tél. : 46-0041-82
CD25 anti-souris conjugué au PE (IL-2Ra, p55)	eBiosciences	Référence 12-0251-82
anti-humain/souris CD44 APC	eBiosciences	Référence 17-0441-82
anti-souris CD62L FITC	eBiosciences	Référence : 11-0621-85
Chambre de comptage améliorée par Neubauer	Marienfeld	Référence 640010
Hyclone Trypan Blue Solution	GE Santé Sciences de la vie	SV30084.01
microscope	Nikon	Nikon Elipse TS100
Anticorps anti-CD3e de souris purifié	Biolégende	100314
Hamster purifié anti-souris CD28	BD Biosciences	553295
Rat purifié anti-souris IFNγ	eBiosciences	Tél. : 16-7312-85
Anticorps anti-IL-4 de souris purifié	Biolégende	504102
Protéine IL-7 de souris recombinante	Système de R&D	407-ML
L'	Merck Millipore	19 à 144
L’ionomycine	sigma	I0634
Inhibiteur de transport de protéines GolgiPlug	BD Biosciences	Référence 51-2301KZ
Kit tampon de fixation intracellulaire et de perméabilisation	eBiosciences	Référence 88-8824-00
anti-souris GM-CSF PE	eBiosciences	Tél. : 12-7331-82
FITC anti-souris IL-17A	Biolégende	506908
APC anti-souris IFN-gamma	Biolégende	Référence 505810