Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dissociation cérébrale et isolement microglial magnétique
REMARQUE : Toutes les manipulations et remises en suspension de cellules doivent être effectuées avec une pipette de 1 000 μL avec la plus grande prudence. L’application d’une action mécanique élevée peut activer ou tuer les cellules microgliales.
- Transvaser 12 morceaux de cerveau (~1,2 g) par tube de dissociation contenant le mélange de dissociation conformément au tableau 1. Pour 24 petits, quatre tubes en C seront nécessaires (figure 1A-B).
- Placez les C-Tubes sur le dissociateur (avec le mode de chauffage). Démarrez le programme NTDK optimisé dans l'équipement conformément aux instructions du fabricant (Figure 1D).
- Centrifuger à 300 x g pendant 20 s (à 4 °C) pour recueillir toutes les cellules. Complétez la dissociation mécanique en pipetant trois fois vers le haut et vers le bas avec une pipette de 1 000 μL (Figure 1E).
- Transférez les cellules dans quatre tubes de 15 mL + crépines. Rincer les passoires avec 10 mL de 1 solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) contenant du Ca2+ et du Mg2+ (HBSS+/+) (figure 1F).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 10 mL de HBSS+/+ (Figure 1G).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez soigneusement la pastille en suspension avec 6 ml de tampon de tri (1 x PBS + 0,5 % BSA) (Figure 1H).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Ajouter 200 μL de solution de microbilles CD11b par tube et remettre en suspension avec précaution (figure 1I).
- Incuber les tubes pendant 15 à 20 minutes à 4 °C. Remettre délicatement la pastille en suspension avec 6 mL de tampon de tri (Figure 1I-J).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez soigneusement la pastille en suspension avec 8 mL de tampon de tri (figure 1K).
- Suivez le programme POSSEL sur le séparateur (voir Tableau des matériaux) pour préparer huit colonnes. Transvaser les cellules de 1 mL par 1 mL sur la colonne. Attendez que toutes les cellules soient passées à travers avant d’ajouter un autre mL. Éluer les cellules CD11b+ sur une plaque d’élution stérile avec 1 mL de tampon de tri (figure 1L).
- Regroupez les cellules CD11b+ dans un nouveau tube de 50 mL (Figure 1M).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettre délicatement la pastille en suspension avec 10 mL de milieu microglial froid (milieu de culture sans sérum de macrophage (SFM) + 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S)) (figure 1N).
- Comptez les cellules CD11b+. À P8, on devrait obtenir ~650 000 cellules par cerveau.
note: Dans le protocole actuel, les cellules étaient comptées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (voir la Table des matières).
- Remettre les cellules en suspension dans un milieu microglial froid jusqu’à une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules/mL et les distribuer dans des plaques de culture cellulaire.
note: Les plaques à 6 puits sont destinées au Western Blot (2 mL par puits) ; les plaques de 12 puits sont destinées à l’analyse RT-qPCR (1 mL par puits) et les plaques de 96 puits sont destinées aux tests phagocytaires (250 μL par puits).
Tableau 1 : Préparation du mélange de dissociation.
| solution | Pour un tube C (μL) | Pour quatre tubes en C (μL) |
| Tampon X | Référence 2850 | Référence 11400 |
| Enzyme P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzyme A (DNAse) | 15 | 60 |
| Zone tampon Y | 30 | 120 |
| total | Référence 2970 | Référence 11880 |
