Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Injection intra-cisternale de souris
REMARQUE : L’ensemble de la procédure est effectué dans l’armoire à flux laminaire pour maintenir des conditions aseptiques.
- Des souris de laboratoire domestiques (âgées de 8 semaines, femelles Balb/c) dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Fournissez des granulés de nourriture et de l’eau à volonté.
- Installez les animaux dans le nouvel environnement pendant 1 semaine avant de commencer l’expérience.
- Avant de commencer l’expérience, pesez et évaluez leur température corporelle.
note: Les souris femelles consanguines Balb/c de huit semaines pèsent en moyenne environ 19 g. La température moyenne des souris de laboratoire varie physiologiquement de 36 à 38 °C.
- Ébouriffez l’animal par le cou, nettoyez la région de l’abdomen avec de l’éthanol à 70 % et injectez du fer dextran i.p. (dissous dans un tampon salin de phosphate à 1 %, 250 mg/kg) dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen murin à l’aide d’une aiguille de 25 G de 0,5 mm x 16 mm, environ 2 à 3 h avant l’infection.
note: L’injection intrapéritonéale a été réalisée dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen murin pour éviter d’endommager les organes abdominaux tels que la vessie, le caecum, etc. L’administration d’une source exogène de fer, sous forme de fer dextran, à des animaux avant l’infection favorise la multiplication bactérienne chez l’hôte.
- Après 2-3 h, effectuez une anesthésie animale avec de la kétamine (50 mg / kg) et de la xylazine (3 mg / kg) et un lubrifiant ophtalmique.
- Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en vous assurant de l’absence de réponse à la douleur lors du pincement de l’orteil.
- Positionnez la souris dans un décubitus sternal et étirez soigneusement les membres et la colonne cervicale pour maintenir la colonne vertébrale en position droite.
- Mélangez délicatement la suspension bactérienne pour maintenir une suspension constante avant de charger une seringue de 30 G d’aiguille x 8 mm.
note: Préparez la suspension bactérienne le plus près possible du temps d’injection ; Pendant ce temps, conservez-le à température ambiante.
- Sur la base du titre bactérien post-décongélation (UFC/mL), procéder au calcul de l’UFC totale à utiliser, par rapport au nombre total d’animaux à infecter (UFC dose bactérienne par nombre d’animaux). Procéder au calcul du volume exact à prélever sur le flacon pour obtenir l’UFC totale en appliquant une proportion entre le titre bactérien post-décongélation (UFC/mL) et l’UFC totale utile pour l’infection de n souris (titre bactérien post-décongélation UFC : ml = UFC totale : x). Établir le volume final par rapport au nombre total d’animaux à infecter.
note: Dans ces expériences, une large gamme de titres allant de 104 à 109 par animal a été utilisée.
- Nettoyez la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70 %.
- Identifier le point d’injection à l’aide d’une aiguille et injecter l’UFC établie de méningocoques (souche de type sauvage et souche mutante isogénique), ou un bouillon de GC complété par du fer dextran (5 mg/kg) comme témoin, dans un volume total de 10 μL dans la citerne géante de souris à travers un trou de fraise occipitale à l’aide d’une aiguille de 30 G x 8 mm.
- Effectuez l’inoculum cisternal en plaçant l’aiguille à la jonction craniocervicale, plus précisément dans l’espace sous-arachnoïdien dorsal. Ventroflex la tête pour rendre cet espace accessible.
- Brièvement, placez l’animal en position couchée latérale, tenez les oreilles à l’écart et fléchissez modérément le cou (90 à 100°). Assurez-vous que la ligne médiane du cou et la tête (du nez à l’occiput) sont dans une position parfaitement parallèle au dessus de la table.
- Touchez les ailes de l’atlas et assurez-vous qu’elles se chevauchent, éliminant ainsi la rotation axiale. Une indentation naturelle peut généralement être touchée sur la ligne médiane où l’aiguille est le plus susceptible de pénétrer dans le trou occipital.
- Jetez la seringue et l’aiguille en toute sécurité après l’injection de Neisseria chez les souris.
- Placez l’animal dans la cage et attendez le réveil et la récupération complète du mouvement.
- Conservez les cages contenant des souris infectées sous une armoire à flux laminaire.
- Surveiller les souris, 24 h après l’infection, pour détecter les signes cliniques de coma selon l’échelle du coma. Échelle de coma : 1 = coma, 2 = ne se tient pas debout après avoir été tourné sur le dos, 3 = se tient debout dans les 30 s, 4 = se tient debout dans les 5 s, activités ambulatoires minimales, 5 = normal.
note: Lorsque chez les animaux une douleur a été enregistrée, une analgésie avec du méloxicam (5 mg/kg i.p. pendant la durée de l’étude) a été administrée.
2. Survie des animaux et dénombrement des UFC
- Survie animale
- Préparez des inoculums bactériens à différentes doses (allant de 104 à 109 UFC par souris) pour infecter les animaux par la voie i.cist.
- Inoculer des souris témoins avec du bouillon GC, complété par du fer dextran (5 mg/kg), de la même manière.
- Surveiller les animaux pour détecter les symptômes cliniques : fourrure ébouriffée, apparence voûtée, hypothermie, perte de poids, léthargie ou moribondage tous les jours pendant toute la durée de l’expérience pendant 168 h (7 jours) au moins deux fois par jour pendant toute la durée de l’expérience.
- Mesurez le poids et la température corporels à l’aide d’une balance numérique et d’un thermomètre rectal, respectivement tous les jours.
- Enregistrez la survie des souris pendant une semaine.
note: Enregistrer la mort naturelle de l’animal après l’infection, tandis que les animaux qui atteignent une valeur de coma de 2 ou qui survivent plus de 168 h d’observation seront euthanasiés.
- Anesthésier les souris dont la valeur de coma est de 2 ou qui survivent pendant le temps d’observation avec de la kétamine (50 mg / kg) et de la xylazine (3 mg / kg) et appliquez une pommade ophtalmique.
- Vérifiez que la réponse à la douleur est absente par un pincement de l’orteil.
- Effectuer l’euthanasie de souris par luxation cervicale et les enregistrer comme mortes pour une analyse statistique.
- Procéder à l’essai de survie animale ou au comptage des UFC sur les animaux infectés.