Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Source et boîtier de la souris
- Dérivez des souris LysM-eGFP sur un fond génétique C57BL/6J. Dérivez des souris LysM-EGFP×MyD88-/- en croisant des souris LysM-EGFP avec des souris MyD88-/- sur un fond C57BL/6J.
- Souris domestiques dans un vivarium. Pour ces études, les animaux ont été hébergés à l’Université de Californie à Davis en groupes avant l’opération et en monologes après l’opération. Utilisez des souris âgées de 10 à 16 semaines.
2. Préparation et quantification bactériennes
- Retirer la souche bioluminescente de S. aureus d’intérêt de l’entreposage à -80 °C pour la décongeler sur de la glace. Traînée sur une plaque de gélose au sang bovin à 5 %. Incuber la plaque striée dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant la nuit (16 h).
note: Dans ce protocole, la souche ALC2906 SH1000 a été utilisée. Cette souche contient le plasmide navette pSK236 avec les promoteurs de la protéine de liaison à la pénicilline 2 fusionnés à la cassette rapporteure luxABCDE de Photohabdus luminescens.
- Préparez le bouillon de soja tryptique (TSB) en mélangeant 0,03 g de poudre TSB par mL d’eau pure, et autoclavez le TSB pour stériliser. Une fois refroidi, ajoutez tous les antibiotiques nécessaires en utilisant une technique stérile. Dans ce protocole, ajouter 10 μg/mL de chloramphénicol au TSB pour sélectionner l’expression du plasmide navette pSK236, qui contient la cassette de bioluminescence luxABCDE.
- Prélever 3 à 4 colonies distinctes de la plaque de S. aureus dans du BST avec 10 μg/mL de chloramphénicol pour commencer une culture pendant la nuit. Incuber les bactéries sur un agitateur d’incubation à 37 °C pendant la nuit (16 h).
- Commencer une nouvelle culture bactérienne à partir de la culture de nuit en diluant un échantillon à 1:50 dans du BST avec 10 μg/mL de chloramphénicol. Culture dans un agitateur d’incubation à 200 tr/min et 37 °C.
- Deux heures après la scission de S. aureus, surveiller la densité optique à 600 nm (OD600) sur un spectrophotomètre. Observez la DO600 en fonction du temps pour trouver la croissance de la phase logarithmique moyenne. Pour la souche SH1000 ALC2906, une DO600 de 0,5 est mi-logarithmique et correspond à une concentration de 1 x 108 UFC/mL (figure 1).
- Lorsque la DO600 est de 0,5, laver les bactéries 1:1 avec du DPBS glacé. Centrifugez les bactéries pendant 10 min à 3 000 x g et 4 °C. Décantez soigneusement le surnageant et ajoutez soigneusement du DPBS réfrigéré supplémentaire et un vortex. Centrifugez à nouveau pendant 10 min à 3 000 x g et 4 °C.
- Décanter soigneusement le surnageant. Remettez en suspension la pastille bactérienne à la concentration souhaitée. Pour ces études, prélever 3 mL de ALC2906 SH1000 et remettre en suspension dans 1,5 mL de PBS, en corrélation avec une concentration bactérienne d’environ 2 x 108 UFC/mL. Gardez les bactéries sur la glace jusqu’à utilisation.
- Pour vérifier la concentration bactérienne, diluez 100 μL de l’échantillon bactérien 1:10 000 et 1:100 000 dans du PBS. Plaque de 20 μL d’aliquotes sur une plaque de gélose. Incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant 16 h. Compter les UFC par examen macroscopique et calculer une concentration bactérienne le lendemain.
3. Lésions cutanées excisionnelles et inoculation de S. aureus
- Administrer 100 μL de chlorhydrate de buprénorphine à 0,03 mg/mL (~0,2 mg/kg) à chaque souris par injection intrapéritonéale.
- Vingt minutes après l’injection, placez 2 à 4 souris dans une chambre avec 2 à 3 LPM d’oxygène avec 2 à 4 % d’isoflurane. Une fois que les souris sont complètement anesthésiées, transférez-les une à la fois dans un cône nasal connecté à 2-3 LPM d’oxygène avec 2-4 % d’isoflurane. Vérifiez que les souris sont complètement anesthésiées en pinçant fermement chaque patte arrière entre le pouce et l’index. Passez à l’étape suivante si l’animal ne répond pas au pincement.
- Rasez une section de 1 pouce sur 2 pouces à l’arrière de la souris avec une tondeuse électrique et nettoyez la zone des coupures de fourrure à l’aide d’une lingette ou d’une gaze propre. Évitez d’utiliser une lotion dépilatoire car elle peut provoquer une inflammation excessive.
- Nettoyez d’abord le dos de la souris avec de la gaze imbibée de povidone iodée à 10 %, puis avec de la gaze imbibée d’éthanol à 70 %. Nettoyez la zone en spirale, en vous déplaçant vers l’extérieur à partir du centre de la zone chirurgicale. Attendez environ 1 minute que la zone chirurgicale sèche avant la chirurgie.
- Tenez le dos rasé de la souris sans serrer entre deux doigts et appuyez fermement sur une biopsie stérile à l’emporte-pièce de 6 mm au centre de la zone chirurgicale préparée. Ne tirez pas sur la peau tendue.
- Tournez la biopsie à l’emporte-pièce pour créer un contour circulaire sur la peau qui traverse complètement la peau dans au moins une section du contour. Veillez à ne pas couper le fascia ou le tissu sous-jacent.
- Utilisez des ciseaux stériles et des pinces pour couper l’épiderme et le derme en suivant le motif circulaire imprimé par la biopsie à l’emporte-pièce.
4. Inoculation de S. aureus
- Remplissez une seringue à insuline de 28 g avec l’inoculant bactérien bioluminescent souhaité. Dans cette étude, administrer une concentration de 1 x 108 UFC/mL (50 μL). N’administrez pas plus de 100 μL de volume.
- Injectez 50 μL d’inoculant entre le fascia et le tissu au centre de la plaie sur le dos de la souris. Assurez-vous que l’inoculant forme une bulle au centre de la plaie avec un minimum de fuite ou de dispersion.
- Tirez le derme sur le côté, tenez la seringue presque parallèle au tissu et poussez lentement la seringue dans le tissu jusqu’à ce qu’une diminution soudaine de la résistance se fasse sentir, ce qui indique un piercing du fascia. Enfoncez délicatement la seringue au centre de la plaie et distribuez lentement l’inoculant. Retirez lentement la seringue de l’animal.
- Injecter le même volume de PBS stérile dans les plaies des animaux non infectés que celui décrit ci-dessus.
- Remettez l’animal dans sa cage. Placez la cage sous une lampe chauffante ou sur un coussin chauffant et surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il se remette de l’anesthésie.
5. In Vivo BLI et FLI
- Initialisez l’ensemble de l’imageur d’animaux via le logiciel de l’instrument. Anesthésie les souris dans une chambre recevant 2-3 LPM d’oxygène avec 2-4 % d’isoflurane. Administrez l’anesthésie aux cônes nasaux à l’intérieur de l’imageur.
- Placez la souris blessée et infectée dans l’imageur. Positionnez la souris de manière à ce que la plaie soit aussi plate que possible. Utilisez la configuration de séquence suivante pour imager les souris.
- Sélectionnez Luminescence et Photographie comme mode d’imagerie. Le temps d’exposition est de 1 min à petit binning et F/stop 1 (luminescence) et F/stop 8 (photographie). Le filtre d’émission est ouvert. Cliquez sur le bouton Acquérir pour enregistrer l’image.
- Sélectionnez Fluorescence et Photographie comme mode d’imagerie. Le temps d’exposition est de 1 s à petit binning et F/stop 1 (fluorescence) et F/stop 8 (photographie) avec une longueur d’onde d’excitation de 465/30 nm et une longueur d’onde d’émission de 520/20 nm avec une intensité de lampe élevée. Cliquez sur le bouton Acquérir pour enregistrer l’image.
- Remettez l’animal dans sa cage et surveillez-le jusqu’à ce qu’il se remette de l’anesthésie.
- Imagez les souris quotidiennement comme décrit ci-dessus.
6. Analyse d’images
- Ouvrez les images à quantifier.
- Placez une grande zone d’intérêt circulaire (ROI) sur toute la zone de la plaie, y compris la peau environnante pour chaque souris de l’image. Les signaux in vivo des neutrophiles FLI EGFP et des signaux in vivo BLI S. aureus s’étendent au-delà du bord de la plaie après plusieurs jours et ont été inclus dans ces études (figures 2A et 2B). Cliquez sur Mesurer le retour sur investissement et enregistrez les valeurs de flux moyen pour chaque souris. Tracez le flux moyen de chaque signal (p/s) en fonction du temps.
- Si l’on souhaite un nombre absolu de neutrophiles ou de S. aureus dans la plaie, effectuez les expériences suivantes.
- Pour corréler le nombre de neutrophiles avec les signaux EGFP FLI in vivo, blessez les souris C57BL/6J comme décrit ci-dessus et transférez une gamme de neutrophiles dérivés de la moelle osseuse (5 x 105 à 1 x 107) à partir de donneurs LysM-EGFP ou LysM-EGFPxMyD88-/- directement sur différents plaies. Imagez comme décrit ci-dessus et corrélez les signaux FLI EGFP in vivo avec la quantité connue de neutrophiles.
- Pour corréler l’UFC de S. aureus aux signaux BLI in vivo, blessez et infectez les souris comme décrit ci-dessus. Le premier jour post-infection, enregistrez in vivo les signaux BLI des souris et euthanasiez et refroidissez immédiatement les carcasses. Exciser la plaie, homogénéiser le tissu et déposer les dilutions bactériennes sur gélose pour une incubation nocturne. Le lendemain, comptez les colonies pour déterminer l’UFC par plaie.
- Pour mesurer la cicatrisation de la plaie, ajustez un retour d’intérêt circulaire sur le bord de la plaie et mesurez la surface de la plaie (cm2) et tracez la variation fractionnaire par rapport à la ligne de base en fonction du temps (Figure 2C).
