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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Induction de l’inflammation de la surface oculaire murine
- Effectuer la préparation immunogène pour l’immunisation.
- Préparez l’immunogène fraîchement le jour de l’immunisation, en mélangeant l’ovalbumine (OVA, 50 mg/mL) et la toxine coqueluche (100 μg/mL) dans une solution saline et l’hydroxyde d’aluminium adjuvant (40 mg/mL) (voir le tableau des matières) dans une proportion de 1:1.
prudence: Effectuer l’ouverture, la reconstitution et la préparation immunogène de la toxine coquelucheuse dans une enceinte de sécurité laminaire. Portez des vêtements de protection et évitez tout contact avec la peau.
- Incuber le mélange d’immunogène et d’adjuvant à température ambiante pendant 30 min et charger 100 μL dans une seringue de 1 mL.
- Effectuer l’injection intrapéritonéale de la solution immunogène chez une souris non anesthésiée.
- Tenez doucement la souris par la queue tout en saisissant la grille de la cage. Tenez fermement la peau du dos et la région du cou entre le pouce et l’index et fixez la queue et les membres inférieurs entre l’annulaire et l’auriculaire contre la paume de la main.
- Gardez la souris fixe avec la tête vers le bas.
- Injecter 100 μL de la solution immunogène préparée dans le quadrant droit ou gauche de la cavité abdominale inférieure.
- Effectuer une provocation de la surface oculaire 2 semaines après l’immunisation.
- Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (2,5 %).
- Appliquez 5 μL d’OVA (50 mg/mL) ou de solution saline (0,9 % NaCl) par œil sur les deux yeux et attendez que la goutte soit absorbée par l’œil. Cela prend ~5 min.
- Répétez la procédure 1 fois par jour pendant 7 jours.
note: L’administration topique de médicaments peut se faire de la même manière.
2. Collecte des exsudats oculaires
- Récupérez les exsudats oculaires formés pendant la phase de provocation en appliquant 50 μL de solution saline stérile sur l’œil immédiatement après la provocation.
3. Excision des tissus de la surface oculaire
- Disséquez les paupières et le globe oculaire en suivant les étapes ci-dessous.
- Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 et luxation cervicale.
- Placez la souris sur une surface plane.
- Désinfectez la zone orbitaire autour de l’œil à l’aide d’un écouvillon imprégné de 70 % d’éthanol.
- Faites une incision entre l’oreille et le sinus rétro-orbitaire et le long de la surface au-dessus de l’os squameux verticalement, en prolongeant l’incision horizontalement sous la paupière inférieure le long de l’os maxillaire et au-dessus de la paupière supérieure le long de l’os frontal. Cela forme une incision autour de l’œil (Figure 1).
- Tenez soigneusement le tissu disséqué autour de l’œil à l’aide d’une pince incurvée et tirez le tissu et le globe oculaire vers l’extérieur.
- Placez les organes excisés dans du PBS stérile.
- Coupez l’excès de tissu musculaire facial autour des paupières supérieures excisées à l’aide d’un scalpel et sous le stéréomicroscope.
- Prélevez la conjonctive en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez la paupière supérieure sur une boîte de Pétri sèche sous le stéréomicroscope.
- À l’aide d’une pince à épiler fine et d’un scalpel, retirez très doucement la couche de muqueuse blanchâtre de la surface interne de la paupière.
- Ensuite, disséquez la cornée en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez le globe oculaire sur une nouvelle boîte de Pétri sèche sur de la glace sèche pendant 3 min.
- Placez la boîte de Pétri sur la surface du banc dans une position stable.
- Faites une petite incision au bord de la cornée à côté du limbe à l’aide de ciseaux fins et tranchants.
- Prolongez l’incision avec le scalpel autour du globe oculaire, en séparant la sclère de la cornée.
- Retirez les restes de l’iris et du cristallin à l’arrière de la cornée en rinçant généreusement avec une solution saline.
