Identification des inhibiteurs de kinases qui modulent la réponse des thymocytes à de forts signaux TCR

Résumé

Source : Chen, E. W., et al. Identification des médiateurs de la signalisation des récepteurs des lymphocytes T via le criblage de banques d’inhibiteurs chimiques. J. Vis. Exp. (2019).

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour identifier les inhibiteurs de kinases à petites molécules qui modulent l’apoptose des thymocytes immatures doublement positifs CD4⁺CD8⁺ auto-réactifs. L’apoptose est induite dans les thymocytes doublement positifs en les activant avec des billes magnétiques enrobées d’anti-CD3 et d’anti-CD28 ; Ceci est suivi d’un traitement par inhibiteur de petites molécules et d’une analyse par cytométrie en flux pour détecter si les inhibiteurs modulent l’expression du marqueur apoptotique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Criblage de banques d’inhibiteurs de kinases (test indépendant de la centrifugeuse)

1. Traitement des thymocytes avec des inhibiteurs de kinases
   1. Préparez une suspension de thymocytes.
   2. Diluer les thymocytes dans un RPMI complet pour obtenir une suspension de thymocytes de 25 x 10⁶ cellules/mL.
   3. Ajouter 40 μL de thymocytes dans chaque puits d’une plaque de petit volume, à l’aide d’une pipette multicanaux. Placez l’assiette sur de la glace.
   4. Diluer les inhibiteurs de la stock-plaque, du DMSO et de la dexaméthasone dans l’IARP complet à raison de quatre parties d’IARP complet pour une partie d’inhibiteur/DMSO/dexaméthasone (facteur de dilution de 5).
      note: Comme les volumes utilisés dans cette plaque de petit volume sont 5 fois plus petits que dans la méthode conventionnelle, les inhibiteurs et les réactifs de contrôle sont dilués cinq fois avant de les ajouter aux thymocytes de la plaque.
   5. Ajouter 0,5 μL d’inhibiteurs de kinases dans la plaque à 96 puits à partir des puits correspondants de la plaque inhibitrice préparée à l’étape 1.1.4.
   6. Préparez huit puits de témoins non traités. Préparez quatre puits de commandes traitées par véhicule en ajoutant 0,5 μL de DMSO préparé à l’étape 1.1.4. Préparez quatre puits de témoins traités à la dexaméthasone à 5 μM, en utilisant la dexaméthasone diluée préparée à l’étape 1.1.4 (figure 1).

2. Stimulation des thymocytes à l’aide de billes anti-CD3/CD28

1. Assurez-vous que les billes sont uniformément remises en suspension. Prenez 1 mL de perles et lavez-les avec 2 mL de PBS. Séparez les billes à l’aide d’un support magnétique et aspirez la solution. Remettre les billes en suspension dans 1 mL de RPMI.
   complet note: Le rapport entre les billes et les cellules est de 1 à 2,5. Ajustez la quantité de billes, en fonction du nombre de puits à stimuler et du nombre de thymocytes utilisés.
2. Ajouter 10 μL de suspension de billes à chaque échantillon traité avec inhibiteur, aux quatre échantillons traités au DMSO et à quatre des huit échantillons non traités. Ajouter 10 μL de RPMI complet dans les quatre puits non traités restants. La figure 1 montre la disposition générale des plaques.
   note: Le volume final des puits est de 50 μL, ce qui correspond à la capacité maximale des puits. Il est important de faire preuve de prudence et de tenir les plaques à la verticale pour éviter les déversements dans les puits croisés.
3. Pour mélanger, agitez la plaque à l’aide d’un agitateur orbital à microplaques. Vous pouvez également mélanger le contenu des puits à l’aide d’une pipette multicanaux.
4. Incuber les thymocytes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 17 à 20 h (ou toute la nuit) avec un couvercle anti-évaporation.

3. Configuration de la rondelle de plaques

REMARQUE : Les instructions de configuration de la rondelle de plaques sont fournies par le fabricant. Les étapes sont brièvement mentionnées ci-dessous. Environ 150 ml de solution sont nécessaires pour chaque étape d’amorçage.

1. Amorcez le système de lavage avec de l’éthanol à 70 % contenant 1 % de Tween 20.
2. Amorcez le système de lavage avec de l’eau déminéralisée contenant 1 % de Tween 20.
3. Amorcez le système de lavage avec le tampon de lavage FACS.

4. Coloration des antigènes de surface

1. Préparez un mélange de coloration d’anticorps contenant des anticorps anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 et anti-CD69. Diluer les anticorps dans le tampon de lavage FACS à un rapport de 1:100 (v/v).
2. Lavez la plaque 9 fois, en utilisant 55 μL de tampon de lavage FACS par lavage, à l’aide du système de lavage automatisé à flux laminaire.
   note: À la fin des lavages, il y aura 25 μL de volume résiduel dans chaque puits.
3. Remettre les cellules en suspension dans 25 μL du mélange d’anticorps colorants préparé à l’étape 1.4.1.
4. Si les échantillons sont transférés à partir d’une plaque à 96 puits, remettre les cellules en suspension dans 50 μL du mélange d’anticorps et transférer les échantillons sur la plaque de petit volume. Cette étape correspond à la méthode numéro 2, telle qu’illustrée à la figure 2A.
5. Pour mélanger, agitez la plaque à l’aide d’un agitateur orbital à microplaques ou mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette multicanaux, et incubez sur de la glace pendant 30 min.

5. Fixation des cellules

1. Lavez la plaque 9 fois, en utilisant 55 μL de tampon de lavage FACS par lavage, en utilisant le système de lavage automatisé à flux laminaire.
2. Ajouter un tampon de fixation/perméabilisation (fourni avec le kit d’apoptose active caspase-3 ; idem avec le tampon de perm/lavage 10x mentionné à l’étape 1.6.1 et l’anticorps anti-caspase-3 à l’étape 1.6.2) à 50 μL par puits.
3. Incuber sur glace pendant 30 min.

6. Coloration intracellulaire pour la caspase active 3

1. Préparez 1 tampon de perm/lavage en diluant 25 ml de tampon de lavage 10 dans 225 ml d’eau ultrapure.
2. Préparez la coloration intracellulaire active de la caspase en ajoutant 1 mL d’anticorps anti-caspase-3 à 2 mL de 1x tampon de perm/lavage. Le rapport entre l’anticorps et le tampon de permanente/lavage est de 1:2.
3. Amorcez le système de lavage avec 1x tampon de permanente/lavage.
4. Lavez la plaque 9x avec 1x tampon perm/wash, à 55 μL pour chaque lavage.
5. Ajouter 25 μL de la coloration à caspase intracellulaire préparée à l’étape 1.6.2 dans tous les puits.
6. Pour mélanger, agitez la plaque à l’aide d’un agitateur orbital à microplaques ou mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette multicanaux, et incubez sur glace pendant 1 h.
7. Lavez la plaque 9x avec 1x tampon perm/wash, à 55 μL pour chaque lavage.
8. Ajouter 25 μL de tampon de lavage FACS dans tous les puits.
9. Transférez les échantillons dans des tubes de microtitration après un mélange adéquat par pipetage.
10. Ajoutez 50 μL supplémentaires de tampon de lavage FACS dans les puits vides et répétez l’étape 1.6.9.
11. Répéter les étapes 1.6.9 et 1.6.10 2 fois jusqu’à ce que 200 μL des échantillons soient prélevés dans les tubes de microtitration.
    note: Les procédures décrites aux étapes 1.6.10 et 1.6.11 ont pour but d’assurer une récupération maximale des cellules à partir de la plaque de petit volume. Si le nombre de cellules n’est pas un problème, après l’étape 1.6.10, il suffit de remplir les tubes de microtitration à 200 μL avec un tampon de lavage FACS.
12. Effectuez une analyse cytométrique en flux des échantillons et analysez les résultats à l’aide d’un programme d’analyse FACS. L’activation de la caspase-3 et l’expression de CD69 sont analysées dans la porte contenant les thymocytes CD4+CD8+DP.

Résultats

Figure 1 : Disposition des plaques du test d’activation des thymocytes. (Haut) Les colonnes 1 et 12 sont réservées aux témoins, tandis que les colonnes 2 à 11 sont des échantillons traités par inhibiteur (beige). Le témoin négatif (non stimulé [NS] ; gris) occupe les puits A1 à D1, et le témoin positif pour la mort cellulaire (traité à la dexaméthasone [DEX] ; violet) occupe les puits E1 à H1. Les colonnes 2 à 12 contiennent ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI	HyClone	SH30027FS
FBS	HyClone	SH3007103
L-Glutamine	HyClone	SH3003401
Pyruvate de sodium	HyClone	SH3023901
10 fois le PBS	Vivantis	PB0344 – 1L
Bibliothèque de dépistage Kinase (96 puits)	Cayman Chemical	Référence 10505	Le contenu exact de la bibliothèque peut varier
Dmso	Sigma Aldrich	D2650
dexaméthasone	Sigma Aldrich	D4902
billes anti-CD3/CD28	Thermo Fisher Scientific	11452D
Kit d’apoptose FITC Active Caspase-3	BD Pharmingen	Référence 550480	Contient un tampon de fixation/perméabilisation, un tampon 10X Perm/Wash et un anticorps anti-caspase 3
Laveur de cellules DA	CURIOX	HT1000
Plaque de cellule DA à 96 puits	CURIOX	96-DC-CL-05
anticorps
CD3e	BioLégende	100236
TCRb	BD Biosciences	553174
CD4	BD Biosciences	740007
CD8	BD Biosciences	563786
CD69	eBiosciences	Référence : 25-0699-42
Inhibiteurs
TG003	Cayman Chemical		De la bibliothèque de dépistage Kinase
TG003	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
PKC 412	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Le doramapimimod	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Le paclitaxel	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
L’erlotinib	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Nécrostatine-5	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
NVP-BEZ235	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Phtalazinone pyrazole	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-879	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
1-NA-PP1	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Torin 1	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Bisindolylmaléimide II	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
BIBF 1120	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SMI-4a	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Bisindolylmaleimide XI (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10657	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AS-703026	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Chlorure de chélérythrine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Tunicamycine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
GSK 1059615	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Le ruxolitinib	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Nécrostatine-1	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SB 505124	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
INK128	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Canertinib (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SB 431542	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
173074 de DP	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Acide valproïque (sel de sodium)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
0325901 de DP	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SB 203580	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
VX-702	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Émodine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CHIR99021	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
bio	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Imatinib (mésylate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Malate de sunitinib	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Gefitinib	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
PP2	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
3-méthyladénine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Bisindolylmaleimide I	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Bisindolylmaléimide IV	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Bisindolylmaléimide V	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
NSC 663284	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
D 4476	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
NU 7026	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
H-9 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Indirubine-3'-monoxime	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
KN-62	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
KN-93	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Réf. CGP 57380	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Iso-Olomoucine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
(S)-Glycyl-H-1152 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Bisindolylmaleimide VIII (acétate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
ST638	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SU 6656	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
LY364947	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SB 203580 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10621	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
YM-201636	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
ZM 447439	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AS-041164	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
NVP-AEW541 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
PP242 (en	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
ABT-869	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10622	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
17β-hydroxy wortmannine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10626	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SU 6668	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10572	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
N,N-diméthylsphingosine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
LY294002	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Référence U-0126	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Staurosporine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
KN-92 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AS-605240 (sel de potassium)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
O-1918	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Y-27632 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Leelamine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
98059	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
169316 de DP	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
TGX-221	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
(S)-H-1152 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AS-605240	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
D-érythro-sphingosine C-18	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
OSU03012	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
JNJ-10198409	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Leelamine (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Acide arachidonique Leelamide	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Acide laurique Leelamide	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AS-252424	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10505	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
PI-103	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
PIK-75 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Inhibiteur de la sphingosine kinase 2	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Piceatannol	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SC-1	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
(R)-Roscovitine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
BAIE-43-9006	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10561	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AS-604850	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Inhibiteur de la α PI3-kinase 2	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
ML-9	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Triciribine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Analogue de l’erbstatine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Kenpaullone	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Olomoucine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-494	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-825	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-1478	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SB 216763	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SB 415286	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-17	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
H-8 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
LFM-A13	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SC-514	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Apigénine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-18	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10554	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
DRB	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
RG-13022	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
RG-14620	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-490	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-82	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-99	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-213	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-183	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Lavendustin C	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
ZM 336372	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
5-Iodotubercidine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SB 202190	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10571	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Nilotinib	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
SP 600125	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
L-thréo-sphingosine C-18	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
H-89	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
HA-1077 (chlorhydrate)	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-370	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Wortmannin	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
AG-1296	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
KT 5823	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Janex 1	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10574	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10575	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10576	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
NH125	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
TWS119	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
NSC 210902	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10577	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CAY10578	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
184161 de DP	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
CCT018159	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase
Myricétine	Cayman Chemical	-	De la bibliothèque de dépistage Kinase

anglais)