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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Dérivation et activation des macrophages de la moelle osseuse avec des anticorps
- Effectuer l’euthanasie par asphyxie au CO2.
- Placez la souris dans la chambre d’induction. Euthanasier la souris avec une anesthésie à 5 % d’isoflurane, pendant 60 à 90 s, jusqu’à ce qu’elle soit immobile et que la respiration soit profonde et lente.
- Désactivez l’anesthésie à l’isoflurane et administrez 6 à 8 L/min de CO2 jusqu’à ce que la souris cesse de respirer. Laissez la souris avec le CO2 allumée pendant au moins 5 minutes supplémentaires. Vérifiez qu’il n’y a plus de battement de cœur ou de respiration. Effectuer une luxation cervicale pour assurer la mort.
REMARQUE : Les souris âgées de 8 à 12 semaines fournissent le rendement le plus élevé de macrophages.
- Vaporisez les pattes de souris avec de l’éthanol à 70 % et épinglez-les avec les bras et les jambes tendus en position couchée sur une planche de mousse. À l’aide de ciseaux et de pinces pour tenir la peau, faites une entaille peu profonde (0,2 cm) pour retirer la peau et la fourrure de la surface de chacune des pattes arrière.
note: Effectuez cette procédure et toutes les manipulations de culture tissulaire dans une hotte stérile.
- Coupez les muscles pour rendre les tibias et les fémurs visibles. Retirez les tibias et les fémurs, en coupant l’os et les muscles juste en dessous de l’articulation de la hanche et au-dessus des chevilles. Coupez autant de muscle que possible.
- Vaporisez les os avec de l'éthanol à 70 % et attendez 1 minute qu'il s'évapore, puis placez-les dans une plaque à 6 puits de milieu de rinçage osseux (milieu de Dulbecco modifié d'Iscove (IMDM), sérum de bovin fœtal à 10 % (FBS)).
- Coupez les extrémités des os en coupant 0,1 cm d’os de la cheville et du haut du fémur afin que la cavité osseuse soit exposée. Assurez-vous que la moelle osseuse est visible et qu’une aiguille de calibre 26 peut être placée dans la cavité osseuse.
- Coupez les os et les muscles pour séparer les tibias et les fémurs des articulations du genou. Insérez une aiguille de calibre 26 attachée à une seringue de 10 ml dans la cavité. Rincer la moelle osseuse dans un tube conique de 50 mL avec 5 mL de milieu de rinçage osseux. Rincer deux tibias et deux fémurs, d’une souris, dans chaque tube de 50 ml.
- Pipetez de haut en bas plusieurs fois ou vortex la moelle à vitesse lente pour disperser doucement les amas Les chaînes de moelle doivent être brisées en petites taches de moelle (moins de 0,5 mm). Remplissez le tube conique à 50 mL avec le milieu de rinçage osseux. Pipeter le contenu du tube conique dans une fiole de 75 cm2 traitée pour culture tissulaire et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 1 h
note: Les macrophages matures et les cellules mésenchymateuses deviendront adhérents au ballon et seront jetés, tandis que les progéniteurs hématopoïétiques souhaités resteront en suspension.
- Pipeter le milieu contenant les progéniteurs hématopoïétiques dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger le tube à 300 x g à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu de culture de facteur de stimulation des colonies de macrophages (MCSF) (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/mL de MCSF, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 150 μM de monothioglycérol (MTG)).
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajouter le milieu pour remettre les cellules en suspension à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL, 1,5 x 107 cellules/flacon dans 30 mL de milieu et pipeter doucement de haut en bas. Pipeter 30 mL de suspension dans une fiole neuve de 75 cm2 traitée pour culture tissulaire.
- Le jour 4 et le jour 7 après la culture initiale à l’étape 1.9, vérifiez que les cellules sont adhérentes et légèrement ramifiées à l’aide d’un microscope à champ clair à contraste de phase inversé. Jetez le milieu contenant les cellules non adhérentes. Lavez les cellules avec de l’IMDM une fois et ajoutez 30 ml de milieu de culture MCSF.
- Lorsque les cellules sont matures au jour 10 (>95 % positif pour F4/80 et Mac-1), vérifiez à nouveau que les cellules sont adhérentes et légèrement.
- Pour mettre en plaque les cellules à stimuler, retirer le milieu de culture de la fiole et ajouter 8 mL de tampon de dissociation cellulaire sans enzymes à base d’EDTA (Table des matériaux). Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C, 5 % CO2.
- Grattez les cellules doucement, avec une petite pression, à l’aide d’un grattoir stérile. Vérifiez au microscope que les cellules se sont détachées de la surface du ballon. Pipeter les cellules dissociées dans un tube conique de 50 ml. Rincer le ballon 3 fois avec 5 mL d’IMDM et mettre la solution de rinçage en fusion avec les cellules qui ont été récoltées. Cellules de centrifugation à 300 x g à température ambiante pendant 5 min.
- Remettre la pastille en suspension dans 3 mL de milieu de culture MCSF par tube conique de 50 mL. Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/mL et mettre en boîte 100 μL de suspension cellulaire (1 x 105 cellules/puits) par puits d’une plaque à fond plat traitée par culture tissulaire à 96 puits.
note: Les os d’une souris généreront suffisamment de cellules pour 100 puits. Si vous le souhaitez, 1 mL de cellules peut être plaqué dans une plaque à 6 puits (traitée par culture tissulaire, fond plat). Un plus grand nombre de cellules (1 x 106 cellules) peut être utile pour les analyses par transfert Western.
- Une fois adhérent, stimulez des puits en double ou en triple avec chacun 10 ng/mL de LPS dans l’IMDM, 30 mg/mL d’IVIg ou IVIg + LPS. Les doses de LPS ou d’IgIV peuvent être titrées pour optimiser les réponses. Laissez les puits en double ou en trois exemplaires comme témoins non stimulés. Incuber pendant 24 h (37 °C, 5 % CO2).
note: Les cellules replaquées doivent adhérer aux puits de culture tissulaire dans un délai de 1 h.
- Recueillir les surnageants cellulaires de chaque puits dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,7 mL et éliminer toute matière particulaire en tournant à 10 000 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant cellulaire et évitez de déranger la pastille. Placez le surnageant cellulaire clarifié dans un tube de microcentrifugation stérile.
note: Les surnageants cellulaires peuvent être dosés pour les cytokines, l’IL-10, et la sous-unité de cytokine, IL-12/23p40, par immuno-enzymatique (ELISA) immédiatement ou stockés à -80 °C à long terme. Suivez le protocole ELISA à partir d’un kit disponible dans le commerce (Table of Materials). D’autres cytokines pro-inflammatoires peuvent être dosées, telles que l’IL-6 et le TNF, car elles sont également réduites par le co-traitement avec la stimulation IVIg + LPS par rapport à la stimulation avec LPS seul. Après stimulation, les cellules adhérentes peuvent être préparées pour des techniques telles que le western blot ou la réaction en chaîne par polymérase quantitative (Q-PCR).