Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Défier des souris in vivo avec des immunoglobulines intraveineuses et des lipopolysaccharides (IVIg+LPS) et récolte de macrophages péritonéaux
- Pesez chaque souris. Calculer le volume d’IgIV (concentration de stock de 100 mg/mL) nécessaire pour fournir une dose finale de 2,5 g/kg de poids corporel. Calculer la quantité de LPS (concentration de stock de 100 μg/mL dans le milieu modifié de Dulbecco d'Iscove (IMDM)) nécessaire pour fournir une dose finale de 0,2 μg/g de poids corporel.
note: Par exemple, pour une souris de 20 g, il faut 500 μL de solution mère d’IgIV et 40 μL d’une solution de LPS de 100 μg/mL.
- Prélevez la quantité requise d’IgIV et de LPS dans une seringue stérile de 1 mL munie d’une aiguille stérile de calibre 26. Pour les souris témoins qui ne recevront pas d’IgIV, remplacez un volume équivalent d’IgIV par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile pH 7,4.
- Ébouriffez la souris d’une main en saisissant sa peau à l’arrière du cou avec votre pouce et votre index et en tenant sa queue et ses pattes arrière avec vos doigts restants. Inclinez son corps vers le sol.
- Placez l'aiguille à un angle de 30 à 40° par rapport à l'abdomen de la souris, dans le quadrant inférieur droit, biseautez vers le haut et insérez 1,5 cm. Injectez l'IgIV + LPS, ou PBS + LPS, par voie intrapéritonéale.
- Après 1h, effectuez l’euthanasie par asphyxie au dioxyde de carbone (CO2).
- Placez la souris dans une chambre d’induction. Euthanasier la souris avec une anesthésie à 5 % d’isoflurane, pendant 60 à 90 s, jusqu’à ce qu’elle soit immobile et que la respiration soit profonde et lente.
- Désactivez l’anesthésie à l’isoflurane et administrez 6 à 8 L/min de CO2 jusqu’à ce que la souris cesse de respirer. Laissez la souris avec le CO2 allumée pendant au moins 5 minutes supplémentaires. Vérifiez qu’il n’y a plus de battement de cœur ou de respiration. Effectuer une luxation cervicale pour assurer la mort.
REMARQUE : Les souris âgées de 8 à 12 semaines fournissent le rendement le plus élevé de macrophages.
- Épinglez la souris sur une planche de mousse, avec les membres écartés. Vaporisez les pièces avec de l’éthanol à 70 %.
note: Effectuez la procédure dans une hotte stérile.
- Faites une incision peu profonde dans la peau (0,2 cm) avec des ciseaux le long de la ligne médiane de la souris, pour éviter de couper la cavité péritonéale. Retirez la peau abdominale du ventre de la souris à l'aide d'une pince, de sorte que la muqueuse de la paroi péritonéale intacte soit visible.
- Remplissez une seringue de 5 ml avec 5 ml de PBS stérile (pH 7,4). Insérez une aiguille de calibre 25 ou 27 en haut de la cavité du côté gauche ou droit vers le centre de la souris avec le biseau de l’aiguille vers le haut.
note: Placez soigneusement l’aiguille dans la souris afin de ne pas injecter de PBS dans les organes, mais plutôt dans l’espace péritonéal.
- Poussez le liquide dans la cavité péritonéale. Retirez l’aiguille de la cavité et massez le péritoine pendant 10 secondes pour déloger les cellules. Insérez l’aiguille en haut de la cavité et évitez les organes. Prélever et placer le liquide de lavage récupéré dans un tube conique de 15 mL sur de la glace.
note: Pour chaque 5 ml de liquide injecté, environ 3,75 ml seront récupérés.
- Répéter l’injection et la récupération (étapes 1.8 - 1.9) 3 fois de plus (volume d’injection total de 20 ml), pour récupérer 15 ml de liquide de lavage au total. Prélever le lavage de chaque souris dans un tube conique séparé de 15 ml.
note: Après l’injection finale, il peut être plus facile d’extraire le liquide des côtés les plus à gauche et à droite de la souris, où le liquide s’est accumulé. Les organes causeront moins d’interférences avec l’aiguille à cette position.
- Faites tourner les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez 1 ml de liquide de lavage récupéré et utilisez-le pour les analyses d'interleukine ou d'IL-10 et d'IL-12/23p40 par dosage immuno-enzymatique (ELISA) conformément aux instructions du fabricant ou congelez-les à -80 °C pour des analyses futures.
note: Pour assurer la comparaison précise entre les traitements pour l’analyse des cytokines du liquide de lavage, effectuez 4 fois des rinçages de 5 mL de la cavité péritonéale pour un volume final de 15 mL. Tout le liquide ne sera pas récupéré à chaque rinçage.
- Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de milieu de placage (IMDM, 10 % de sérum de veau fœtal, FBS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine) par souris rincée. Compter les macrophages viables.
note: Les macrophages seront légèrement plus grands que les autres cellules péritonéales. Le rendement typique est de 5 x 105 - 1 x 106 macrophages/souris à l’aide d’une souris C57BL/6 de type sauvage.
optionnel: Si un grand nombre de globules rouges sont présents dans la pastille cellulaire, effectuez une étape de lyse selon les instructions du fabricant pour les éliminer.
- Remettre les cellules en suspension dans le milieu de placage à raison de 1 x 106 macrophages/mL et la plaque de 100 μL par puits dans une plaque traitée pour la culture tissulaire à fond plat de 96 puits.
note: Il peut être nécessaire de regrouper les cellules de plus d’une souris pour une expérience. Par exemple, si une souris avait 5 x 105 macrophages, 500 μL de milieu de placage seraient nécessaires.
- Incuber les cellules pendant 1 h à 37 °C, 5 % de CO2 pour permettre aux macrophages de devenir adhérents. Les cellules adhérentes sont les macrophages péritonéaux. Éliminez les surnageants cellulaires et les cellules non adhérentes. Rincez les puits deux fois avec 200 μL d’IMDM (préchauffé à 37 °C), attendez 10 s et inclinez lentement la plaque. Remplacez le support de placage. Incuber les cellules à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 30 min avant la stimulation.
- Une fois adhérent, stimulez des puits en double ou en triple avec chacun 10 ng/mL de LPS dans l’IMDM, 30 mg/mL d’IVIg ou IVIg+LPS. Les doses de LPS ou d’IgIV peuvent être titrées pour optimiser les réponses. Laissez les puits en double ou en trois exemplaires comme témoins non stimulés. Incuber pendant 24 h (37 °C, 5 % CO2).
note: Les cellules replaquées doivent adhérer aux puits de culture tissulaire dans un délai de 1 h. Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou congelés et stockés à -80 °C pour l’analyse des cytokines par ELISA.
- Recueillir les surnageants cellulaires de chaque puits dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,7 mL et éliminer toute matière particulaire en tournant à 10 000 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant cellulaire et évitez de déranger la pastille. Placez le surnageant cellulaire clarifié dans un tube de microcentrifugation stérile.
note: Les surnageants cellulaires peuvent être dosés immédiatement par ELISA pour les cytokines, l’IL-10, et la sous-unité de cytokine, l’IL-12/23p40, ou stockés à -80 °C à long terme. Suivez le protocole ELISA du kit disponible dans le commerce (Table of Materials). D’autres cytokines pro-inflammatoires peuvent être dosées, telles que l’IL-6 et le facteur de nécrose tumorale (TNF), car elles sont également réduites par le co-traitement avec la stimulation IVIg+LPS par rapport à la stimulation avec LPS seul. Après stimulation, les cellules adhérentes peuvent être préparées pour des techniques telles que le western blot ou la réaction en chaîne par polymérase quantitative (Q-PCR).
