Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Immunisation des souris
- Préparez un mélange vaccinal principal dans un tampon physiologique stérile tel qu’une solution saline ou DPS.
note: Le volume total du mélange devrait être supérieur de 10 % à celui requis pour l’immunisation de l’ensemble du groupe. Les concentrations de la composition du vaccin sont détaillées ci-dessous aux étapes 1.1.1 et 1.1.2. Transportez les articles au vivarium sur de la glace.
- Pour les études sur B. pertuss, inclure les groupes de vaccins suivants : vaccin acellulaire contre la coqueluche (PVa) et PVa+ facteur de colonisation A de Bordetella (BcfA). De plus, utilisez de l’alun, des antigènes vaccinaux seuls (hémagglutinine filamenteuse (FHA) et pertactine (Prn)), et des souris naïves (non immunisées) comme groupes témoins.
REMARQUE : L’aPV représente 1/5e de la dose humaine d’un aPV approuvé par la FDA, qui est composé d’anatoxine tétanique, d’anatoxine diphtérique réduite, d’anatoxine coqueluche (PT), d’hémagglutinine filamenteuse (FHA) et de pertactine (Prn) adsorbées sur des sels d’aluminium. Une dose humaine de l’aPV actuelle contre la coqueluche est de 0,5 mL, par conséquent, 1/5e d’une dose est de 0,1 mL. Les volumes d’aPV + BcfA sont de 0,1 mL d’aPV (1/5e de la dose humaine) + 0,046 mL de BcfA (30 μg) par souris. Le volume maximal qui peut être délivré en toute sécurité à un muscle est de 0,1 ml. Étant donné que le volume du vaccin aPV + BcfA est supérieur à 0,1 mL, le vaccin doit être administré dans les deux épaules, divisé à peu près également, afin d’être administré en toute sécurité.
- Pour préparer un vaccin expérimental, pour une dose, combiner 1 μg de FHA et 0,5 μg de Prn avec 50 μg de gel d’hydroxyde d’aluminium dans du PBS stérile. Laisser l’aPV expérimental se mélanger sur un rouleau de laboratoire pendant 15 min à température ambiante (RT). Ensuite, faites tourner le tube à 18 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et remettez le contenu en suspension dans 1 mL de PBS stérile.
- Dans le vivarium, installez l’appareil d’anesthésie (Figure 1).
note: Assurez-vous qu’il y a des niveaux adéquats d’oxygène et d’isoflurane dans leurs réservoirs respectifs avant utilisation. Pesez le bidon de récupération d’isoflurane et remplacez-le lorsque son poids augmente de 50 g.
- Nettoyez soigneusement l’enceinte de sécurité biologique (BSC) et placez la chambre d’induction propre à l’intérieur de la BSC. Connectez les lignes d’anesthésie et de piégeage de l’appareil d’anesthésie à la chambre d’induction. Ouvrez le réservoir d’oxygène via le régulateur pour vous assurer que l’oxygène circule et réglez le niveau sur 1,5-2 L/min.
- Placez les souris de l’âge désiré (6 à 12 semaines) dans la chambre d’induction. Allumez l’isoflurane à 2,5-3 % afin d’anesthésier légèrement les souris. Surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils ne bougent plus dans la chambre et que leur respiration ait ralenti.
- Testez le niveau d’induction en pinçant les orteils, en observant tout mouvement réflexe. S’il n’y en a pas, les souris sont prêtes à injecter.
REMARQUE : Dans cette expérience, toute la cage d’animaux a été anesthésiée en une seule fois. On peut choisir d’anesthésier les animaux individuellement pour l’injection ou d’injecter les animaux sans anesthésie. L’une ou l’autre de ces méthodes est appropriée.
- Entre-temps, préparer des seringues à insuline de 1 mL (28G1/2) avec 0,1 mL de vaccin chacune. Lorsque les animaux sont complètement induits, retirez un animal de la chambre et posez la souris ventralement sur une serviette ou un coussin.
- Administrer le vaccin par voie intramusculaire. Avec la seringue à un angle de 45° et le biseau vers le haut, insérez la seringue à ~5 mm dans le deltoïde de la souris et injectez le vaccin.
note: Le quartier arrière/flanc peut être utilisé comme site d’injection à la place du deltoïde.
- Après l’injection, maintenez l’aiguille insérée dans le muscle pendant ~5-10 s. Une fois le volume distribué, tournez la seringue à 180° de manière à ce que le biseau soit tourné vers l’extérieur pour créer une étanchéité et éviter la fuite du vaccin. Ensuite, retirez lentement l’aiguille du site d’injection.
- Remettez la souris dans la cage. Répétez la procédure avec tous les animaux du groupe désigné.
- Éteignez l’isoflurane et rincez la chambre d’induction avec de l’oxygène avant d’anesthésier la prochaine cage de souris.
- Surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils soient tous alertes et qu’ils se déplacent dans la cage. Remettez la cage à l’endroit où se trouve le logement.
- Surveiller les animaux toutes les 12 heures après la vaccination, jusqu’à 48 heures, pour détecter des symptômes cliniques de morbidité tels qu’un pelage rugueux ou négligé, une démarche lente ou une respiration laborieuse. Si les symptômes persistent, consultez le vétérinaire de l’établissement et retirez les souris de l’étude si nécessaire.
- Quatre semaines après l’immunisation initiale, stimulez les souris en anesthésiant et en administrant des injections intramusculaires dans le deltoïde droit de la souris avec la même formulation vaccinale que celle administrée précédemment.
- Encore une fois, surveillez l’animal pour tout symptôme clinique. Hébergez les animaux pendant 2 semaines supplémentaires, puis procédez à l’infection.
2. Modèle d’infection intranasale murine
- Dans le vivarium, réglez les conditions d’oxygène et d’anesthésie comme décrit aux étapes 1.3 et 1.4. Comme décrit à l’étape 1.5, placez les souris dans la chambre pour anesthésier. Surveillez les animaux jusqu’à ce que l’anesthésie fasse effet.
- Lorsque les souris sont anesthésiées, retirez un animal à la fois de la chambre d’induction. Saisissez la souris par la peau du thorax dorsal, derrière les omoplates et le cou. Positionnez la souris à la verticale pour accéder au nez.
- À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, appliquez lentement 40 à 50 μL de l’inoculum bactérien de B. pertussis sur les narines de la souris (20 à 25 μL dans chaque nare). Tenez la souris jusqu’à ce que tout l’inoculum ait été inhalé par l’animal. Si une partie de l’inoculum bouillonne, récupérez les bulles et réinstillez-les dans les narines. Administrer une quantité égale de PBS stérile à un groupe de souris en tant que contrôle négatif.
- Comme aux étapes 1.10 à 1.12, retournez les animaux inoculés dans leur cage et surveillez-les jusqu’à ce qu’ils soient alertes et en mouvement. Remettez la cage dans son espace d’hébergement d’origine sur le rack. Rincez la chambre d’induction avec de l’oxygène pour éliminer l’isoflurane résiduel avant d’anesthésier le prochain groupe d’animaux. Surveillez les animaux pendant 48 heures après l’infection.
- En laboratoire, des dilutions en série de l’inoculum sur plaque, dans du PBS stérile, pour vérifier les unités formant colonies (UFC) réelles délivrées aux souris. Boîte de 0,1 mL de dilutions sur des plaques à 10 % de BG + Sm (plaques de gélose Bordet-Gengou complétées par 10 % de sang de mouton défibriné et 100 μg/mL de streptomycine) (figure 2A). Placez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et faites pousser pendant 4 jours. Compter et calculer les UFC de l’inoculum délivré à la souris (figure 2B).
3. Prélèvement de tissus animaux après infection
- Préparez-vous à la dissection de souris et au prélèvement de tissus.
- Stérilisez tous les outils (ciseaux grossiers et fins, ciseaux courbés, pinces fines, pilons à granulés et épandeurs triangulaires) nécessaires au traitement des tissus dans un autoclave. Scellez les outils dans des sachets de stérilisation. Enveloppez le verre, dénoncez les homogénéisateurs dans du papier d’aluminium et ajoutez du ruban adhésif autoclave pour indiquer la stérilité.
- Préparez les plaques de gélose 1 ou 2 jours avant le prélèvement des tissus pour vous assurer que les plaques sont solidifiées avant l’utilisation. Pour B. pertussis, utiliser 10 % de BG + Sm. Des plaques d’étiquetage pour le poumon de chaque souris avec les dilutions souhaitées, déterminées empiriquement pour chaque expérience.
- Remplir et étiqueter les tubes de dilution CFU. Ajouter 0,9 mL de PBS stérile dans des tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL en fonction du nombre d’organes à traiter et des dilutions par organe.
- Remplir et étiqueter les tubes pour le prélèvement de tissus :
- Poumons : ajouter 2 mL de caséine stérile à 1 % dans du PBS dans un tube conique stérile de 15 mL et conserver à 4 °C. Pour prélever des poumons pour l’histologie, ajoutez 2 ml de formol tamponné neutre (FBN) à 10 % et conservez-le à RT.
- De l’éthanol frais à 70 % doit être préparé pour remplir les béchers et les vaporisateurs pour la dissection.
- Le jour de la récolte, transportez tout le matériel au vivarium sur une charrette. Nettoyez le BSC et installez l’appareil d’anesthésie comme aux étapes 1.3 et 1.4.
- Placez les souris à disséquer dans la chambre d’induction et, avec l’oxygène qui circule, allumez l’isoflurane à 5 % et attendez que les animaux soient inconscients. Retirez les souris une à la fois et disloquez l’animal par voie cervicale comme méthode secondaire pour assurer la mort. Suite à la luxation cervicale, l’euthanasie doit être confirmée par l’absence de fréquence respiratoire et/ou l’absence de réflexe de retrait (test de pincement des orteils).
- Positionnez la souris, côté ventral vers le haut, sur la planche de dissection et épinglez les bras et les jambes ouverts. Vaporisez le corps de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
- À l’aide d’une pince, saisissez la peau sous l’abdomen, au centre du bassin. À l’aide de ciseaux tranchants, faites une coupe verticale jusqu’à la mandibule. Ensuite, disséquez la peau loin de la paroi péritonéale en écartant les deux couches, en utilisant de petits mouvements avec les ciseaux fermés. Placez la peau sur les côtés de la carcasse pour créer un champ dégagé pour le prélèvement d’organes stériles.
- Utilisez une pince pour stabiliser la cage thoracique au stade xiphoïde et ouvrez le diaphragme. Les poumons doivent se dégonfler et tomber vers la colonne vertébrale. Ouvrez la cage thoracique sur les côtés pour retirer le plastron.
- Isolez et retirez le lobe supérieur du poumon droit, en coupant les artères et les veines pulmonaires. Placez le lobe dans un tube conique de 15 mL contenant 10 % de FBN et placez le tube à RT pendant au moins 24 h pour fixer le tissu. Isolez les lobes restants du poumon droit et du poumon gauche. Placez les lobes dans un tube conique de 15 mL contenant 2 mL de caséine à 1 % dans du PBS et placez-le sur de la glace.
- Jetez la carcasse dans un sac à risque biologique. Avant de disséquer l’animal suivant, rincez les outils à l’eau déminéralisée, puis placez-les dans un bécher rempli d’éthanol à 70 %. Retirez les outils, secouez l’excès d’éthanol, puis procédez à la dissection suivante.
- Disséquez chaque souris en suivant les étapes mentionnées ci-dessus.
- Traitez les tissus comme décrit ci-dessous.
4. Traitement des poumons
- Transférez les poumons (dans 2 ml de caséine à 1 % dans du PBS) dans un homogénéisateur stérile de 15 mL de Dounce. Utilisez un pilon pour homogénéiser les tissus. Dissociez-vous jusqu’à ce qu’il ne reste plus de grosses particules de tissu. Remettez la suspension homogénéisée dans le tube d’origine de 15 ml.
- Prélever une aliquote de 0,3 mL pour le placage des UFC et centrifuger l’homogénat à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Prélever et aliquote le surnageant dans des aliquotes de 0,5 mL dans des tubes de microcentrifugation pré-étiquetés. Conserver les échantillons à -20 °C jusqu’à l’analyse des cytokines par ELISA.
- Préparer les dilutions choisies en diluant en série 0,1 mL de suspension pulmonaire homogénéisée dans des tubes de dilution (0,9 mL de PBS stérile). Déposer 0,1 mL de dilutions choisies empiriquement sur des plaques pré-étiquetées à 10 % BG + Sm et les étaler à l’aide d’un épandeur triangulaire stérile.
- Incuber les plaques à 37 °C à l’air ambiant pendant 4 jours.
- Compter et calculer les UFC/poumon (figure 3). Brièvement, multipliez les nombres d’UFC récupérés par le facteur de dilution de la plaque, puis également par le volume total dans lequel l’organe a été traité. Les calculs des UFC sont ensuite transformés en valeurs Log10 pour chaque animal et représentés graphiquement.
- Les plaques de 30 à 300 colonies sont comptées facilement et avec précision. Les plaques comportant moins de 6 colonies ne doivent pas être utilisées pour les calculs, car un si faible nombre de colonies introduit des erreurs. Pour obtenir une limite inférieure de détection, le volume total dans lequel un organe a été homogénéisé est divisé par le volume utilisé pour la détection sur une plaque à partir de l’homogénat non dilué (p. ex., un volume total de 2 mL divisé par 0,1 mL d’homogénat non dilué équivaut à la limite inférieure de 20 UFC détectables).
