REMARQUE : Les étapes suivantes ont été effectuées à l’aide de cellules B IIA1.6.
1. Activation des lymphocytes B avec des billes recouvertes d’antigène
- Préparation de billes enrobées d’antigène
- Pour activer les lymphocytes B, utilisez des billes NH2 enrobées de manière covalente avec de l’antigène (billes enrobées d’Ag), qui sont préparées à l’aide de 50 μL (~20 x 106 billes) de 3 μm de2 billes NH avec des antigènes activateurs (BCR-ligand+) ou non activateurs (BCR-ligand-).
- Pour l'IIA1.6, les lymphocytes B utilisent le fragment anti-IgG-F(ab')2 comme ligand+ BCR et l'albumine sérique bovine (BSA) comme ligand-BCR. Pour activer les lymphocytes B primaires ou la lignée de cellules B IgM+, utilisez l'anti-IgM-F(ab')2 comme ligand+ BCR et la BSA comme ligand-BCR-.
note: Pour éviter la liaison des ligands au récepteur Fc, utilisez des fragments d'anticorps F(ab') ou F(ab')2 au lieu d'anticorps complets.
- Pour procéder à la préparation des billes enrobées d'Ag, placez les billes dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique afin de maximiser la récupération des billes lors de la manipulation de l'échantillon. Ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour laver les billes et centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant.
- Remettre les billes en suspension avec 500 μL de glutaraldéhyde à 8 % pour activer les groupes NH2 et tourner pendant 4 h à température ambiante (RT).
prudence: La solution mère de glutaraldéhyde ne doit être utilisée que dans une hotte chimique. Suivez les instructions de la fiche de données de sécurité (FDS).
- Centrifugez les billes à 16 000 x g pendant 5 min, retirez le glutaraldéhyde et lavez les billes trois fois de plus avec 1 mL de 1x PBS.
prudence: La solution de glutaraldéhyde doit être jetée comme déchet chimique dangereux.
- Remettez en suspension les billes activées dans 100 μL de 1x PBS. L’échantillon peut être divisé en deux tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique : 50 μL pour le ligand-BCR+ et 50 μL pour le ligand-BCR.
- Pour préparer la solution d’antigène, utilisez deux tubes de microcentrifugation de 2 mL à faible liaison protéique contenant 100 μg/mL de solution d’antigène dans 150 μL de PBS : un tube avec BCR-ligand+ et l’autre avec BCR-ligand-.
- Ajouter 50 μL de solution de billes activées dans chaque tube contenant 150 μL de solution d’antigène, vortex, et tourner pendant la nuit à 4 °C.
- Ajouter 500 μL de BSA à 10 mg/mL pour bloquer les groupes NH2 réactifs restants sur les billes et tourner pendant 1 h à 4 °C.
- Centrifuger les billes à 16 000 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant. Lavez les perles avec du froid 1x PBS trois fois de plus.
- Remettre en suspension les billes activées dans 70 μL de 1x PBS.
- Pour déterminer la concentration finale de billes enrobées d’Ag, diluez un petit volume de billes dans du PBS (1:200) et comptez à l’aide d’un hémocytomètre. Conserver ensuite à 4 °C jusqu’à utilisation.
note: Les billes revêtues d’agriculture ne doivent pas être stockées plus de 1 mois.
2. Préparation des lamelles de poly-L-lysine
- Avant l’essai d’activation des lymphocytes B avec des billes enrobées d’Ag, préparer des lamelles enrobées de poly-L-lysine (PLL-coverslips). À l’aide d’un tube de 50 mL contenant 40 mL de solution PLL à 0,01 % p/v et immergez-y les lamelles de 12 mm de diamètre. Rotation de nuit à RT.
- Lavez les lamelles avec 1x PBS et laissez sécher sur un couvercle à plaque à 24 puits recouvert d’un film de paraffine. Procédez à l’activation des lymphocytes B.
3. Activation des lymphocytes B
- Pour commencer l’activation des lymphocytes B avec des billes, diluez d’abord la lignée de lymphocytes B IIA1.6 à 1,5 x 106 cellules/mL dans un milieu CLICK (RPMI-1640 complété par 2 mM de L-Alanine-L-Glutamine + 55 μM de bêta-mercaptoéthanol + 1 mM de pyruvate + 100 U/mL de pénicilline + 100 μg/mL de streptomycine) + 5 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur.
- Combinez 100 μL (150 000 cellules) de cellules B IIA1.6 avec des billes recouvertes d’Ag dans un rapport de 1:1 dans des tubes de 0,6 mL. Mélangez doucement à l’aide d’un vortex et semez sur des lamelles de protection PLL. Incuber à différents moments dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C / 5 % CO2). Les points de temps d’activation typiques sont 0, 30, 60 et 120 min. Pour le temps 0, placez les lamelles PLL dans le couvercle de la plaque à 24 puits sur de la glace. Ajouter le mélange de billes enrobées de cellules Ag et incuber 5 min sur ice.
note: Il est important de mélanger par vortex au lieu de pipeter de haut en bas, car cela pourrait réduire le nombre de billes dans l’échantillon, en raison de leur accumulation dans la pointe en plastique de la pipette. Utilisez des billes recouvertes d’un ligand BCR comme contrôle négatif pour chaque essai. Nous vous recommandons d’activer d’abord le temps d’incubation le plus long, puis les points temporels suivants. Calculez les intervalles d’activation des échantillons de manière à ce qu’ils soient prêts à être fixés en même temps.
- Ajoutez 100 μL de PBS froid 1x à chaque lamelle pour arrêter l’activation et poursuivre le protocole d’immunofluorescence.
