Activation de lymphocytes B sur une lamelle enrobée d’antigène

Résumé

Source : Ibañez-Vega, J., et al., Étude de la dynamique des organites dans les lymphocytes B lors de la formation des synapses immunitaires. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’activation des lymphocytes B in vitro. Le processus implique une interaction de l’antigène avec les récepteurs des lymphocytes B, conduisant au remodelage du cytosquelette, à la formation de synapses immunitaires, au mouvement des lysosomes, à l’internalisation de l’antigène, au traitement et à la présentation ultérieure sur les molécules du CMH pour l’activation des lymphocytes B.

Protocole

1. Préparation des lamelles de poly-L-lysine

1. Avant l’essai d’activation des lymphocytes B avec des billes enrobées d’Ag, préparer des lamelles enrobées de poly-L-lysine (PLL-coverslips). À l’aide d’un tube de 50 mL contenant 40 mL de solution PLL à 0,01 % p/v et immergez-y les lamelles de 12 mm de diamètre. Rotation de nuit à RT.
2. Lavez les lamelles avec 1xPBS et laissez sécher sur un couvercle à plaque à 24 puits recouvert d’un film de paraffine. Procédez à l’activation des lymphocytes B.

2. Activation des lymphocytes B sur des lamelles recouvertes d’antigène

1. Préparation de lamelles enrobées d’antigène
   1. Avant l’activation, préparez la solution d’antigène (1x PBS contenant 10 μg/mL de BCR-ligand+ et 0,5 μg/mL d’anti-souris CD45R/B220).
   2. REMARQUE : Envisagez de préparer les lamelles la veille du dosage. B220 améliore l’adhésion des lymphocytes B, cependant, le BCR-Ligand+ est suffisant pour générer la réponse d’étalement.
   3. Placez la lamelle de 12 mm sur un couvercle à plaque de 24 puits recouvert d’un film de paraffine, ajoutez 40 μL de solution d’antigène sur chaque lamelle et incubez à 4 °C pendant la nuit. Scellez la plaque pour éviter l’évaporation de la solution d’antigène.
   4. Lavez les lamelles avec 1x PBS et séchez-les à l’air.
2. Activation des lymphocytes B
   1. Pour démarrer l’activation, diluez les lymphocytes B IIA1.6 à 1,5 x 10⁶ cellules/mL dans un milieu CLICK + 5 % FBS.
   2. Ajouter 100 μL de cellules sur une lamelle enrobée d’antigène (Ag-coverslip) et activer pendant différents points temporels dans un incubateur de cellules à 37 °C / 5 % de CO₂. Les points de temps d’activation typiques sont 0, 30 et 60 min.
      note: Comme dans la section 1, nous vous recommandons de commencer par le point de temps d’activation le plus long afin de fixer tous les échantillons en même temps.
   3. Pour le temps 0, placez le couvercle de la plaque à 24 puits contenant la lamelle Ag sur de la glace et ajoutez les cellules. Incuber 5 min sur glace.
   4. Aspirez soigneusement le support sur chaque lamelle Ag, puis ajoutez 100 μL de PBS 1x froid pour arrêter l’activation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules de lymphome B de souris IIA1.6 (variante A20)	ATCC	TIB-208	Lymphome murin à cellules B d’origine Balb/c qui exprime à sa surface une BCR contenant des IgG sans FcγIIR
CaCl2	Winkler	Référence : CA-0520
glycine	Winkler	BM-0820
HyClone Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03	Inactivation de la chaleur à 56 °C pendant 30 min
Kcl	Winkler	Réf. PO-1260
NaCl	Winkler	SO-1455
Parafilm	L	Réf. P1150-2
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122	liquide
Poly-L-lysine	sigma	Réf. P8920	Diluer avec de l’eau stérile
Réf. RPMI-1640	Industries biologiques	Référence 01-104-1A
Pyruvate de sodium	Thermo Fisher Scientific	11360070
Tube 50 ml	Corning	353043
2-mercaptoéthanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
glutamine	Thermo Fisher Scientific	35050061
Anticorps IgG anti-souris de chèvre	Jackson ImmunoResearch	Référence 315-005-003	Ligand positif IIA1.6