Effet de l’anticorps anti C-fms sur l’ostéoclastogenèse dans les cellules de moelle osseuse de souris in vitro

Résumé

Source : Marahleh, A., et al. Effet de l’anticorps anti-c-fms sur la formation et la prolifération des précurseurs d’ostéoclastes in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’effet de différentes concentrations d’anticorps anti-c-fms sur l’ostéoclastogenèse, qui est le processus de formation des ostéoclastes à partir des progéniteurs des ostéoclastes.

Protocole

1. Génération de BMM

1. Semez 1 x 10⁷ cellules/10 mL dans une boîte de culture de 10 cm et ajoutez du M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est de 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 3 jours.
2. Après 3 jours, retirer le milieu de culture, laver vigoureusement les cellules avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois pour éliminer les cellules non adhérentes, ajouter 5 ml de trypsine-EDTA à température ambiante 0,02 % dans du PBS et incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 5 min.
3. Détachez les cellules par un pipetage minutieux. Assurez-vous que les cellules ont été détachées en observant la culture au microscope (les cellules doivent apparaître arrondies et flottantes dans le milieu). Si les cellules restent attachées, répétez soigneusement le pipetage pour les détacher. Lorsque les cellules ont été détachées, ajoutez 5 mL de α-MEM pour inactiver la réaction.
4. Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et laver avec 5 mL de α-MEM.
5. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de α-MEM.
6. Effectuez un comptage cellulaire.
7. Semez 1 x 10⁶ cellules/10 mL dans une boîte de culture de 10 cm et ajoutez du M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est de 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 3 jours.

2. Génération d’ostéoclastes à partir de BMM en tant que précurseurs d’ostéoclastes

1. Après 3 jours, récoltez les cellules attachées qui représentent le BMM comme des précurseurs d’ostéoclastes, en suivant les étapes 1.2-1.7.
2. Amorcer le BMM à 5 x 10⁴ cellules/200 μL de α-MEM dans une plaque à 96 puits. Ajouter du RANKL pour une concentration finale de 50 ng/mL ou du TNF-α pour une concentration finale de 100 ng/mL. Ajouter du M-CSF pour une concentration finale de 100 ng/mL dans chaque puits.
3. Ajouter des anticorps anti-c-fms (concentrations finales de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) dans chaque puits.
4. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 4 jours. Changez de support tous les deux jours pendant 4 jours.

3. Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)

1. Après 4 jours d’incubation, aspirez doucement le milieu de culture de chaque puits. Lavez chaque puits une fois avec 200 μL de PBS à température ambiante.
2. Ajouter 200 μL de formol à 10 % dans chaque puits pour la fixation et incuber pendant 1 h à température ambiante. Aspirez le formol et lavez chaque puits 3 fois avec de l’eau déminéralisée.
3. Ajouter 200 μL de Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS dans chaque puits pour la perméabilisation et incuber pendant 1 h à température ambiante. Aspirez le Triton X-100 et lavez chaque puits 3 fois avec de l’eau déminéralisée.
4. Ajouter 200 μL de solution de coloration TRAP dans chaque puits. Visualisez la tache au microscope. Il faudra de 10 à 30 minutes pour que la tache se développe correctement.
5. Aspirez la tache et lavez chaque puits avec de l’eau déminéralisée 3 fois, puis séchez à l’air. Conservez-le à température ambiante pour l’utiliser lors d’une observation plus approfondie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-c-Fms			AFS98, un anticorps c-Fms monoclonal, antimurin, de rat (IgG2a)
RANKL	PEPROTECH	315-11	Ligand sRANK murin recombinant, Source : E.coli
M-CSF			1/10 vol de surnageant de culture de lignées cellulaires CMG14–12 à 5X106 cellules dans une boîte de culture en suspension de 10 cm.
α-MEM	Wako		avec de la L-Glutamine et du rouge de phénol
Sérum fœtal bovin	Biowest	S1820-500	Sérum fœtal bovin origine française
Plat de culture	Corning		Plat de style 100 mm x 20 mm
Plaque à 96 puits	Thermofisher Scientific		Nun clon Delta surface