1. Infection virale chez la drosophile
- Infectez les mouches par nano-injection et effectuez des tests de survie.
- Tirez sur les capillaires pour préparer les aiguilles d’injection, remplissez l’aiguille d’injection avec de l’huile et assemblez l’injecteur.
- Anesthésie les mouches sur le coussin sous un léger flux de CO2. Inoculer les mouches par injection intrathoracique de 50,6 nL de solution virale (100 PFU, dilué avec un tampon Tris-HCl, pH 7,2). Injecter au moins 3 flacons de mouches (20 mouches par flacon).
note: L’injection est chronophage (généralement 100 mouches par heure) et la réplication du virus de la drosophile C (DCV) est très rapide, il est donc très important de noter l’heure exacte sur le tube une fois chaque flacon terminé (20 mouches). L’injection de tampon uniquement est définie comme une commande fictive. Habituellement, les mouches adultes mâles sont préférées, car les résultats sont plus stables et reproductibles que lors de l’utilisation de femelles, car les variations hormonales pendant l’accouplement et la reproduction peuvent influencer la lecture des femelles.
- Cultivez les mouches injectées à 25 °C, 60 % d’humidité dans un cycle clair/obscurité normal. Fournissez quotidiennement des aliments frais aux mouches et notez le nombre de mouches mortes.
- Effectuez au moins 3 répétitions biologiques et tracez la courbe de survie.
- Pour l’analyse statistique des données de survie, générez des courbes de survie de Kaplan-Meier à l’aide d’un logiciel statistique. Effectuez un test de log-rank pour calculer les valeurs P. Dans la table de survie, entrez les informations pour chaque sujet. Le logiciel calcule ensuite le pourcentage de survie à chaque instant et trace un graphique de survie de Kaplan-Meier.
note: N’ajoutez PAS de levure supplémentaire dans le flacon. Par rapport aux témoins simulés, les mouches infectées par le DCV ont parfois de l’ascite et sont maladroites, ce qui les rend vulnérables aux levures collantes. Il est préférable d’enregistrer plus de points dans le temps dans l’expérience préliminaire pour savoir à quel moment la mort massive se produira pour les mouches infectées. En général, les mouches infectées meurent rarement dans les deux premiers jours, même pour les lignées mutantes Dicer-2. Pour la mouche w1118 exempte de Wolbachia (Bloomington 5905) infectée par 100 PFU de DCV, cette fenêtre de temps est d’environ 3 à 5 jours après l’infection. Les mouches des fruits qui meurent dans les 0,5 heures suivant l’injection ne devraient pas être considérées comme mortelles, car elles peuvent être tuées par des blessures causées par une aiguille et non par une infection virale.
2. Mesure de la charge DCV par dosage à effet cytopathique (CPE)
- Le jour 1, infectez les mouches mâles comme décrit aux étapes 1.1.1-1.1.2. Regroupez les mouches injectées par groupes de 20 et maintenez-les en croissance avec de la nourriture fraîche pour mouches pendant la durée souhaitée (généralement pendant 24 heures ou 3 jours). Fournissez quotidiennement de la nourriture fraîche aux mouches.
- Le jour 2, ensemencer les cellules de Drosophila S2* dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm à une densité d’environ 5 x 106 à 1 x 107 cellules/mL.
- Le jour 3, prélever 5 mouches (sous un léger flux de CO2) et les broyer dans un tube à centrifuger de 1,5 mL pendant 30 s avec 200 μL de tampon Tris et des billes de céramique à l’aide d’un homogénéisateur. Stockez les échantillons à -80 °C ou passez immédiatement à l’étape suivante.
- Vortex soigneusement l’échantillon. À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’un filtre de 0,22 μm, filtrez le surnageant vers un nouveau tube de 1,5 mL.
- Effectuer des dilutions en série de 10 fois du surnageant avec un milieu complet pour les cellules S2*. Ajouter 50 μL de dilutions dans le puits. Ajouter 50 μL de milieu de culture sans virus dans le puits classé comme puits témoin négatif.
note: Pour chaque taux de dilution, 8 puits ont été utilisés. Comme le rendement typique du DCV est d’environ 108-10 9 PFU/mL, la dilution doit couvrir au moins ~10-5-10-10.
- Le jour 4, observez l’EPC avec un microscope à fond clair avec un objectif 20X ou 40X. Classez un puits dans lequel les cellules semblent floues et le milieu est plein de fragments comme un « puits positif », et un puits dans lequel la morphologie cellulaire est normale comme un « puits négatif ».
- Marquez les puits positifs ou négatifs CPE avec + ou -, respectivement. Calculer la dose infectieuse moyenne de culture tissulaire virale (DTID50).
3. Charge DCV mesurée par qRT-PCR
- Le jour 1, infectez les mouches comme décrit ci-dessus. Injectez en groupe des mouches mâles (20 mouches/groupe) et faites-les pousser avec de la nourriture fraîche pour mouches pendant la durée souhaitée, généralement pendant 24 h ou 3 jours. Fournissez quotidiennement de la nourriture fraîche aux mouches.
- Le jour 3, prélever 5 mouches sous un léger flux de CO2 dans un tube de 1,5 mL avec 200 μL de tampon de lyse et 20 billes de céramique (diamètre = 0,5 mm), et broyer les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur à grande vitesse pendant 30 s. Ajouter 800 μL de tampon de lyse supplémentaire dans chaque tube et stocker les échantillons à -80 °C ou effectuer immédiatement l’extraction de l’ARN et la qRT-PCR.
- Préparez des pointes sans RNase, des tubes et de l’eau désionisée, traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC) et filtrée à une membrane de 0,22 μm. Ajouter 200 μL de chloroforme (≥99,5 %) dans l’échantillon et agiter vigoureusement pendant 15 s à la main. Incuber pendant 5 min ou plus à température ambiante jusqu’à ce que la phase aqueuse et la phase organique soient clairement séparées.
note: Le chloroforme est extrêmement dangereux et doit être manipulé avec soin. Ne vortex PAS l’échantillon, ce qui augmenterait le risque de contamination de l’ADN.
- Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Prélever 400 μL de surnageant et transférer le surnageant dans de nouveaux tubes. Mélanger avec le même volume d’isopropanol (≥ 99,5 %), retourner doucement les échantillons 20 fois à la main, puis précipiter pendant 10 min ou plus à température ambiante.
note: Les précipitations à -20 °C augmenteront le rendement en ARN.
- Centrifuger des échantillons à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Des pastilles d’ARN blanc sont visibles au fond du tube.
- Jetez le surnageant et ajoutez 1 mL d’éthanol à 70 % (éthanol dans l’eau DEPC) et retournez quelques fois pour laver l’ARN.
- Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et l’ARN sec pendant 5 à 10 min ; L’ARN doit devenir transparent.
- Ajoutez 50 μL d’eau DEPC à l’échantillon, pipetez quelques fois et vortex.
- Prélever 3 μL d’ARN pour titrer la concentration en ARN. Quantifier l’ARN à 260 nm. Normalement, la concentration d’ARN extraite par ce protocole est d’environ 100-500 μg/μL, ce qui convient à la synthèse de l’ADNc.
- Utilisez 2 μg d’ARN pour la synthèse de l’ADNc. Diluer l’échantillon à 100 μL avec du ddH2O et le conserver à -20 °C.
- Effectuez qRT-PCR selon les instructions du fabricant et exécutez qRT-PCR.
note: Pour la synthèse de l’ADNc du DCV, les amorces aléatoires ont beaucoup mieux fonctionné que les amorces Poly A. L’expression de l’ARNm DCV est normalisée en ARNm endogène de la protéine ribosomique 49 (rp49). Amorces oligonucléotidiques utilisées dans cette partie :
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (avant) et
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (revers) ;
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (avant) et
5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (marche arrière) ;
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (avant) et
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (marche arrière) ;
ARN induit par le virus 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (avant) et
5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (revers).
