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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement des monocytes humains et différenciation en macrophages
- Prélever du sang anticoagulé chez des individus sains anonymisés dans une banque de sang régionale et isoler les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comme indiqué ci-dessous.
note: Effectuez toutes les étapes dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire. N’utilisez que des tubes stériles et portez des gants. Ajoutez 10 % d’eau de Javel à tous les produits sanguins lors de l’élimination. La solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) (1x) ou la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (sans Ca2+ et Mg2+) peuvent être utilisées de manière interchangeable.
- Préparez le tampon de dilution : Complétez 1 PBS stérile avec 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 0,5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
- Préparez le milieu de culture : Complétez le milieu RPMI-1640 avec du FBS (10 % (v/v)), du glutamax (2 mM) et de la pénicilline/streptomycine (50 U.I./50 μg/mL)
- Prérefroidissez le tampon de fonctionnement (table des matériaux) selon le protocole du fabricant.
- Diluez le sang total avec deux volumes de tampon de dilution. À l’aide d’une pipette sérologique, transvaser 15 mL de sang anticoagulé dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de tampon de dilution. Mélanger délicatement par inversion.
- Pour chaque tranche de 10 mL de sang total ou 30 mL de sang dilué, ajoutez 15 mL du milieu à gradient de densité dans un tube vide de 50 mL.
- Superposer lentement et régulièrement le milieu à gradient de densité de l’étape 1.1.5 avec 30 mL de sang dilué à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL. Gardez la pointe de la pipette contre la paroi du tube et le tube incliné.
- Transférez soigneusement les tubes dans une centrifugeuse à godets oscillants. Évitez de perturber les deux phases. Centrifuger les tubes à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 25 min avec l’accélération et la décélération réglées à la valeur minimale.
- Retirez soigneusement la couche supérieure de plasma (transparente) à l’aide d’une pipette de 10 ml et jetez-la dans un contenant contenant de l’eau de Javel (10 %).
- Prélever la couche interphasique (blanche) des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC, figure 1) à l’aide d’une pipette de 10 mL et transférer dans un tube frais de 50 mL. Combinez la couche blanche de différents tubes du même donneur dans un tube de 50 mL jusqu’à 30 mL.
- Amener chaque tube à un volume total de 50 mL à l’aide du tampon de dilution de l’étape 1.1.1 et centrifuger à 300 x g et 4 °C pendant 10 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL et le jeter dans un récipient avec de l’eau de Javel (10 %).
- Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 1 mL de la mémoire tampon de coulée pré-refroidie de l’étape 1.1.3 à l’aide d’une micropipette p1000. Combinez des suspensions cellulaires du même donneur dans un nouveau tube de 15 ml. Porter le volume de chaque tube à 15 mL avec un tampon de coulée pré-refroidi et bien mélanger par inversion.
- Prélever une aliquote de 20 μL de la suspension cellulaire de l’étape 1.1.11 et préparer une dilution de 1:100 en utilisant 1x PBS stérile. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifuger la suspension cellulaire de l’étape 1.1.11 à 300 x g et 4 °C pendant 10 min et prélever le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL. Si nécessaire, utilisez une micropipette p200 pour retirer complètement le surnageant.
- Remettez en suspension les PBMC isolés dans 80 μL de tampon de fonctionnement MACS pré-refroidi pour chaque 1 x 107 cellules, pour un total de 800 μL de tampon.
- Ajouter 20 μL de microbilles CD14 anti-humaines par 1 x 107 cellules ou jusqu’à 100 μL par échantillon de sang (~100 mL de sang non dilué). Bien mélanger par inversion et placer sur un rotateur de tube pendant 20 min avec un mélange continu à 4 °C.
- Retirer les échantillons du rotateur de tubes, ajouter 10 mL de tampon de fonctionnement prérefroidi dans chaque tube et centrifuger à 300 x g (accélération = 5, décélération = 5) et 4 °C pendant 10 min.
- Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL et remettre en suspension jusqu’à 1 x 108 cellules dans 500 μL de tampon de fonctionnement pré-refroidi (2 x 108/mL).
- Effectuez l'isolement des cellules CD14-positives par tri magnétique des cellules à l'aide d'un système manuel ou automatisé (Table des matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Prélever une aliquote de 20 μL de la suspension cellulaire de l’étape 1.1.18 après sélection CD14 positive et préparer une dilution de 1:100 en utilisant 1x PBS stérile. Déterminez le nombre de cellules en comptant les cellules sur un hémocytomètre.
- Centrifuger les cellules CD14 positives à 300 x g et RT pendant 10 min. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL ou d’un système de vide.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire à partir de l’étape 1.1.20 dans un milieu de culture préchauffé à partir de l’étape 1.1.2 jusqu’à une densité cellulaire finale de 1 x 107 cellules/mL.
- Ensemencez les monocytes CD14-positifs isolés à une densité cellulaire de 5 x 106 cellules.
- Sur une boîte de culture tissulaire de 10 cm, ajouter 10 mL de milieu de culture de l’étape 1.1.2 complété par 50 ng/mL de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF).
- Ajouter 0,5 mL de la suspension cellulaire de l’étape 1.1.21 dans le milieu de culture dans le sens de la goutte à goutte et agiter doucement la plaque. Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % CO2) pendant la nuit.
- Le lendemain, aspirez le milieu à l’aide d’un système d’aspiration pour éliminer les cellules qui ne se sont pas fixées pendant la nuit. Ajouter 10 mL de milieu de culture frais supplémenté en GM-CSF (50 ng/mL) et incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % de CO2) pendant 7 jours pour permettre une différenciation complète (voir la figure 2A pour l’apparition des monocytes CD14+ à différents stades de différenciation dans le GM-CSF). Changez le milieu de culture tous les 2-3 jours et complétez avec du GM-CSF frais (50 ng/mL) à chaque fois.
2. Préparation des composants d’électroporation
REMARQUE : Ce protocole est conçu pour une pointe 10 μL-Neon (Table des Matériaux). Pour chaque transfection, utilisez 1-2 x 105 cellules. Il est recommandé d’ensemencer les cellules transfectées sur une plaque de 48 puits ou une boîte à 8 puits (cellules transfectées de 10 μL par puits). 1x DPBS stériles (sans Ca2+ et Mg2+) peut être utilisé à la place du PBS.
- Le 7e jour, préparez un milieu sans antibiotiques en complétant le milieu RPMI-1640 avec du FBS (10 % (v/v)) et du glutamax (2 mM).
- Placez le milieu RPMI-1640 sans sérum, la solution de trypsine-EDTA (0,25 %), 1 PBS stérile (sans Ca2+ et Mg2+) et le milieu de culture complet de l’étape 1.1.2 dans un bain-marie à 37 °C.
- Si vous utilisez des boîtes à fond de verre (pour la microscopie confocale), enduire les boîtes de bromhydrate de poly-D-lysine.
- Enduire une boîte à 8 compartiments avec 200 μL de bromhydrate de poly-D-lysine (0,1 mg/mL dans 1x PBS stérile) et incuber pendant 5 min à RT.
- Aspirez la solution de poly-D-lysine et lavez le verre une fois avec 1x PBS stérile. Aspirez le PBS et passez à l’étape 2.4.
- Ajouter 200 μL de milieu exempt d’antibiotiques par puits de la plaque de 48 puits ou de la boîte à 8 cuves et pré-incuber dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % CO2) jusqu’au moment de mettre en plaque les cellules transfectées.
3. Préparation des cellules pour l’électroporation
REMARQUE : Le rendement de MDM à partir d’une boîte de 10 cm à la fin de la période de différenciation de 7 jours est d’environ 1,5 x 106 cellules. 1x DPBS stérile (sans Ca2+ et Mg2+) peut être utilisé à la place du PBS. Ce protocole a été optimisé pour que la plupart des macrophages soient détachés de la plaque avec le maintien de la viabilité et de l’intégrité cellulaires. Le MDM est difficile à détacher des plaques de culture cellulaire. Par conséquent, il peut être nécessaire d’effectuer deux fois les étapes 3.2 et 3.3 pour dissocier les cellules. Veiller à ce que chaque temps d’incubation avec trypsine-EDTA (0,25 %) ne dépasse pas 5 min.
- Aspirez le milieu des macrophages entièrement différenciés sur des plats de 10 cm et lavez la monocouche cellulaire avec un milieu RPMI-1640 chaud sans sérum. Assurez-vous de retirer complètement le support.
- Récolter les cellules en ajoutant 2 mL de solution tiède de trypsine-EDTA (0,25 %) par boîte de 10 cm et incuber dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % CO2) pendant 5 min.
- Complétez le détachement cellulaire en pipetant doucement la solution de trypsine-EDTA (0,25 %) de haut en bas sur toute la surface de la parabole à l’aide d’une micropipette p1000. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu de culture complet chaud à l’étape 1.1.2.
- Approchez l’antenne d’un microscope à champ clair et vérifiez qu’il n’y a pas de détachement cellulaire dans différents champs de vision. S’il y a encore une quantité considérable de cellules attachées, répétez les étapes 3.2-3.3.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à RT.
- Aspirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans 10 mL de 1 PBS stérile préchauffé à 37 °C. Prélever une aliquote de 20 μL pour déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Prélever 1 à 2 x 105 cellules par transfection prévue et les placer dans un tube de 15 ml. Porter à un volume final de 15 mL avec 1x PBS stérile préchauffé. Centrifugeuse à 250 x g pendant 5 min à RT.
- Aspirez à nouveau le PBS et centrifugez une fois de plus pendant 1 min à 250 x g. Retirez tout résidu de PBS de la pastille de cellule à l’aide d’une micropipette p200.
4. Nucléofection des composants BiFC de la caspase dans des macrophages dérivés de monocytes humains
REMARQUE : Cette section du protocole est réalisée à l’aide du système de transfection au néon (Table des matériaux). Ce protocole décrit les étapes de transfectation de 1 à 2 x 10cellules 5 à l’aide d’une pointe au néon de 10 μL (Table des matériaux). Si vous utilisez une pointe néon de 100 μL, augmentez l’échelle en conséquence. Évitez d’exposer les cellules au tampon de remise en suspension R pendant plus de 15 minutes, car cela pourrait diminuer la viabilité cellulaire et l’efficacité de la transfection.
- Diluez le plasmide rapporteur (c’est-à-dire mCherry ou dsRedmito à 100 ng/μL) dans de l’eau sans nucléase ou un tampon TE 0,5x pour visualiser les cellules transfectées.
- Diluer les plasmides de caspase BiFC à une concentration appropriée dans de l’eau exempte de nucléases ou un tampon 0,5x TE, de sorte que le volume total des plasmides ne dépasse pas 30 % du volume total de transfection de 10 μL (c.-à-d. 300 ng/μL de C1 Pro-VC et 300 ng/μL de C1 Pro-VN).
- Préparez un microtube stérile de 1,5 mL par transfection prévue et ajoutez la quantité appropriée de plasmide rapporteur (c.-à-d. 50 ng ou 0,5 μL) et de plasmides BiFC de caspase (c.-à-d. 300 ng ou 1 μL de C1 Pro-VC et 300 ng ou 1 μL de fragment C1 Pro-VN). Gardez les microtubes dans le capot en tout temps.
- Placez la station de pipette, l’appareil, les pointes, les tubes d’électroporation et la pipette dans une hotte à flux laminaire stérile.
note: La station de pipette, l’appareil, les pointes, les tubes d’électroporation et la pipette sont inclus dans le système de transfection néon.
- Connectez le connecteur haute tension et le connecteur du capteur de la station de pipette aux ports arrière de l'appareil conformément aux instructions du fabricant. Gardez la station de pipette à proximité de l’appareil.
- Connectez le cordon d’alimentation à l’entrée secteur arrière et procédez à la connexion de l’appareil à la prise électrique. Appuyez sur l’interrupteur d’alimentation pour allumer l’appareil.
- Entrez les paramètres de transfection dans l’écran de démarrage qui s’affiche lorsque l’appareil est allumé et correctement connecté. Appuyez sur Tension, entrez 1000 et appuyez sur Done pour régler la tension sur 1000 V. Appuyez sur Largeur, entrez 40 et appuyez sur Terminé pour régler la durée de l’impulsion sur 40 ms. Enfin, appuyez sur # Pulses, entrez 2 et appuyez sur Terminé pour régler le nombre d’impulsions électriques sur 2.
- Prenez l’un des tubes d’électroporation (fournis dans le kit) et remplissez-le de 3 mL de tampon électrolytique E (pour les pointes de 10 μL et fourni dans le kit) à RT. Insérez le tube d’électroporation dans le support de pipette sur la station de pipette. Assurez-vous que l’électrode sur le côté du tube est tournée vers l’intérieur et qu’un clic se fait entendre lorsque le tube est inséré.
- Prenez la pastille de cellule de l’étape 3.8 et ajoutez 10 μL de tampon R de remise en suspension préchauffé (fourni dans le kit) pour chaque 1-2 x 105 cellules. Mélangez délicatement à l’aide d’une micropipette p20. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire dans chaque tube configuré à l’étape 4.3 et mélanger doucement avec une micropipette p20.
- Prenez la pipette et insérez une pointe en appuyant sur le bouton poussoir de la deuxième butée. Assurez-vous que la pince ramasse complètement la tige de montage du piston dans la pointe et qu’aucun espace n’est observé dans la tête supérieure de la pipette.
- Pour aspirer l’échantillon, appuyez sur le bouton-poussoir de la pipette jusqu’à la première butée et plongez-le dans le premier tube contenant le mélange d’ADN cellule/plasmide. Aspirez lentement le mélange dans l’embout de la pipette.
note: Évitez les bulles d’air car elles peuvent provoquer des arcs électriques pendant l’électroporation et, si elles sont détectées par l’appareil, peuvent empêcher la délivrance de l’impulsion électrique. Si des bulles d’air sont observées, libérez le contenu dans le tube et essayez à nouveau d’aspirer.
- Insérez très soigneusement la pipette avec l’échantillon dans le porte-pipette. Assurez-vous que la pipette s’enclenche et qu’elle est correctement placée.
- Appuyez sur Start sur l’écran tactile et attendez que les impulsions électriques soient délivrées. Un message à l’écran indiquera l’achèvement de la réunion.
- Retirez lentement la pipette de la station et ajoutez immédiatement la suspension cellulaire transfectée dans le puits correspondant avec un milieu sans antibiotiques préchauffé à partir de l’étape 2.4 en appuyant lentement sur le bouton-poussoir jusqu’à la première butée.
note: Cette pointe peut être réutilisée jusqu’à trois fois pour le même plasmide ; sinon, jetez-le dans un conteneur de déchets biologiques dangereux en appuyant sur le bouton-poussoir jusqu’à la deuxième butée.
- Répétez les étapes 4.10 à 4.14 pour chaque tube contenant un mélange d’ADN cellulaire/plasmidique.
- Secouez doucement la plaque avec des cellules transfectées et incubez pendant 1 à 3 h dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % CO2).
- Ajouter dans chaque puits 200 μL de milieu de culture préchauffé (milieu complet) à partir de l’étape 1.1.2. Placez à nouveau la parabole dans l’incubateur de culture de tissus humidifié (37 °C, 5 % CO2). Prévoyez au moins 24 h pour l’expression des gènes.
- Le lendemain, inspectez la viabilité cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope à épifluorescence.
- Allumez le microscope à épifluorescence et le boîtier de la source de lumière fluorescente selon les instructions du fabricant et placez la boîte de culture sur la platine du microscope.
- Sélectionnez l’objectif 10x ou 20x et le filtre 568 nm (RFP).
- Pour estimer la viabilité des cellules, appuyez sur le bouton LED en lumière transmise (TL) pour visualiser toutes les cellules du champ sélectionné. Tout en regardant dans l’oculaire du microscope, tournez le bouton de mise au point jusqu’à ce que les cellules soient observées et vérifiez la fixation des cellules dans le champ sélectionné.
note: Les cellules entièrement attachées représentent les cellules viables tandis que les cellules flottantes représentent les cellules non viables. Si la confluence du puits est élevée, la présence de cellules non attachées pourrait être le résultat d’une surestimation du nombre de cellules et non le résultat d’une faible viabilité. Cependant, une faible confluence accompagnée d’une teneur élevée en cellules flottantes signifie une faible viabilité qui peut résulter de la formation d’arcs électriques lors de l’électroporation, de la toxicité plasmidique ou d’une surexposition au tampon R en suspension. N’utilisez pas de puits qui affichent ce dernier comportement.
- Pour estimer l’efficacité de la transfection, concentrez-vous sur les cellules du champ sélectionné sous la lumière transmise, comme décrit ci-dessus. Comptez le nombre total de cellules dans le champ sélectionné. Avec la LED de lumière transmise (TL) éteinte, appuyez sur le bouton LED de lumière réfléchie (RL) pour l’allumer.
- Concentrez-vous sur la fluorescence du gène rapporteur (globules rouges) et comptez le nombre total de globules fluorescents rouges. Répétez ces étapes (4.18.4-4.18.5) pour au moins deux autres champs par puits.
5. Traitement de l’acquisition de données MDM et caspase BiFC transfectées
REMARQUE : Si vous prévoyez d’imager les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocale, il est conseillé de traiter les cellules avec qVD-OPh (20 μM) pendant 1 h avant le traitement avec le stimulus choisi pour prévenir la mort cellulaire dépendante de la caspase (principalement l’apoptose). Ceci est utilisé en imagerie pour empêcher les cellules de se détacher en raison de l’apoptose, ce qui les rend très difficiles à imager lorsqu’elles sortent du plan focal. Notez que le recrutement des caspases sur la plateforme d’activation et la caspase associée BiFC ne dépend pas de l’activité catalytique de la caspase, et par conséquent, l’inhibition des caspases n’affectera pas cette étape.
- Traiter avec le stimulus choisi environ 24 h après la transfection et incuber aussi longtemps que nécessaire pour chaque médicament.
- Préparez le milieu d’imagerie en complétant le milieu de culture à partir de l’étape 1.1.2 avec de l’Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) et du 2-mercaptoéthanol (55 μM).
- Ajoutez la concentration souhaitée de stimulus au support d’imagerie préchauffé et mélangez doucement.
- Retirez soigneusement le milieu des cellules à l’aide d’une micropipette p1000 et ajoutez 500 μL de la solution de stimulus de l’étape 5.1.2 sur le côté du puits.
- Pour faire fonctionner des puits de contrôle non traités, ajoutez un milieu d’imagerie sans le stimulus.
- Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire humidifié (37 °C, 5 % CO2) aussi longtemps que indiqué pour chaque traitement.
- Visualisez les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocal.
- Allumez le microscope et la source de lumière fluorescente en suivant les instructions du fabricant.
- Sélectionnez l’objectif 10x ou 20x et placez la boîte de culture sur la platine du microscope.
- À l’aide de l’oculaire du microscope, trouvez les cellules sous le filtre 568 nm et concentrez-vous sur les cellules exprimant le rapporteur dsRedmito/mCherry (globules rouges).
- Comptez tous les globules rouges dans le champ visuel et notez le nombre.
- Dans le même champ visuel, passez aux filtres 488 ou 512 (GFP ou YFP), comptez le nombre de globules rouges qui sont également verts (Venus positif ou BiFC positif) et notez le nombre.
- Comptez au moins 100 cellules positives dsRedmito/mCherry à partir d’un minimum de trois champs visuels individuels.
