Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de l’expérience
- Fabrication du dispositif de culture d’organes intestinaux (3 jours)
- À l’aide d’une imprimante 3D, imprimez les moules en plastique réutilisables pour le dispositif de culture d’organes (le dispositif a 6 puits, avec 24 petits et grands trous, et pour le couvercle du couvercle de l’appareil).
REMARQUE : Ces moules en plastique peuvent être utilisés pour la fabrication de nombreux appareils.
- Insérez les aiguilles à extrémité émoussée (22 G et 18 G) à la position appropriée dans le moule de l’appareil et coulez environ 20 g de mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS) (rapport poids 1:10, base / catalyseur) pour un ensemble de l’appareil et du couvercle.
- Placez les moules dans une chambre à vide pendant 30 min, pour éliminer les bulles d’air du mélange PDMS.
- Incuber les moules à 55 °C pendant la nuit, pour terminer la polymérisation PDMS.
- Lorsque le PDMS est réglé, retirez les aiguilles du moule et libérez soigneusement le dispositif de culture et le couvercle des moules en plastique.
- Éliminez les résidus de PDMS du contour du puits à l’aide d’une lame chirurgicale. Fixez l’appareil PDMS et le couvercle de l’appareil sur une vitre de protection (microlames de 75 mm x 50 mm) à l’aide d’un adhésif silicone non toxique et laissez les pièces prendre toute la nuit (appliquez la colle sur le côté lisse de l’appareil).
- Insérez douze aiguilles de 22 G pour la lumière et douze aiguilles de 18 G pour le puits. Fixez toutes les aiguilles en place à l’aide de silicone et laissez-les prendre toute la nuit. Insérez deux aiguilles de 18 G dans le couvercle du couvercle pour une bonne circulation de l’air à l’intérieur et à l’extérieur de l’appareil de culture d’organes intestinaux.
- Vérifiez que toutes les aiguilles ne fuient pas à l’aide d’une seringue remplie d’eau. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite des puits en remplissant les puits d’eau.
- Placez deux nœuds chirurgicaux sur chaque aiguille de 22 G qui sera reliée au côlon. Placez l’appareil et le couvercle dans un sac en papier autoclave et stérilisez-le dans un autoclave.
- Milieu de culture (0,5 h)
- Dans une hotte biologique, mélangez ce qui suit (dans un tube de 50 ml) : 37 ml de milieu Dulbecco's modifié (IMDM) d'Iscove, 10 ml de sérum de remplacement KSR, 1 ml de supplément de B27, 0,5 ml de supplément de N2, 0,5 ml de tampon 1 M HEPES et 0,5 ml d'acides aminés non essentiels.
- Filtrez et stockez le milieu complet à 4 °C.
- Préparation des tubes et des outils chirurgicaux
- Coupez la longueur appropriée de tubes pour la lumière d’entrée, le puits d’entrée, la lumière de sortie et le puits de sortie (12 tubes courts et 12 tubes longs). Connectez un adaptateur approprié de chaque côté du tube.
- Préparez les outils chirurgicaux : ciseaux droits, 4 pinces fines et 2 pinces tranchantes.
- Placez les tubes et les outils chirurgicaux dans un sac en papier autoclave et stérilisez-les à l’aide d’un autoclave.
- Préparez l’entrée luminale (stimulation souhaitée - bactéries, selles, médicaments, etc.).
- Avant l’expérience, déterminer la charge bactérienne de la culture bactérienne, par dilutions en série, et culture dans des conditions aérobies et/ou anaérobies.
- Après avoir calculé la charge bactérienne, diluez les cultures bactériennes dans un milieu de culture tissulaire stérile pour obtenir la concentration bactérienne requise. Pour les échantillons fécaux, filtrer à l’aide d’une passoire de 100 μm.
note: Pour une stimulation non bactérienne (médicaments, métabolites, etc.), diluez la substance à la concentration requise à l’aide du milieu de culture intestinale.
2. Préparation de la configuration de l’expérience
- À l’intérieur de l’incubateur de culture d’organes, allumez l’unité de chauffage et réglez-la à 37 °C.
- Installez les pompes ainsi que les seringues d’entrée et de sortie.
- Entrée de milieu de culture tissulaire
- Dans une hotte biologique ou à flux laminaire, remplissez les seringues du puits d’entrée avec un milieu de culture complet. Le volume final dépend de la durée de l'expérience et du débit ; habituellement 1 mL/h plus un milieu supplémentaire pour la purge.
- Connectez les tubes aux seringues à l’aide de l’adaptateur Luer-lock. Placez les seringues remplies dans les pousse-seringues.
- Purgez les seringues d’entrée. Assurez-vous que le fluide de puits s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé.
- Entrée luminale
- Remplissez les seringues d’entrée luminale avec un traitement de stimulation (bactéries, médicaments, etc.). Le volume dépend de la durée de l’expérience et du débit (généralement 30 μL/h plus un milieu supplémentaire pour la purge).
- Connectez les tubes aux seringues à l’aide de l’adaptateur Luer-lock. Placez les seringues remplies dans les pousse-seringues.
- Purger les seringues d’entrée. Assurez-vous que la stimulation s’écoule de tous les tubes dans un verre usagé. Attention à ne pas contaminer les différentes stimulations.
- Sorties
- Placez les seringues vides dans les pousse-seringues de sortie (réglez le mode de pompe sur « retrait »).
- Configuration de l’appareil
- Réglez le régulateur qui contrôle le débit du mélange gazeux (95 % O2 + 5 % CO2) pour un débit doux et minimal.
- Examinez l’appareil dans un capot laminaire.
- Rincez les aiguilles de l’appareil avec de l’IMDM stérile pour laver les aiguilles.
- Ajouter 500 μL de milieu de culture stérile dans chaque puits de l’appareil.
- Préparation à la dissection tissulaire
- Placez les outils chirurgicaux stériles à l’intérieur du capuchon laminaire.
- Remplissez une seringue de 10 ml avec de l’IMDM stérile et connectez-y une aiguille à bout émoussé stérile (autoclave) de 22 g pour rincer le côlon.
3. Cultures d’organes
- Sacrifice de souris et dissection tissulaire
- Dans un capuchon laminaire, sacrifiez des souris âgées de 12 à 14 jours par décapitation. Vaporisez les souris avec de l’éthanol à 70 % et placez-les sur une plaque en plastique.
- À l’aide de ciseaux tranchants et de pinces, disséquez la souris et retirez le tube digestif de l’estomac à l’anus en coupant toute la graisse et les tissus conjonctifs. Coupez le côlon et placez-le sur une nouvelle assiette.
note: Minimisez le contact avec le tissu du côlon. Ne touchez pas la partie médiane du tissu du côlon. Tenez le tissu doucement et uniquement sur les bords du tissu.
- Rinçage et lavage du côlon
- À l’aide d’un microscope de dissection, rincer doucement le contenu du côlon avec de l’IMDM stérile (sur la face proximale) à l’aide de la seringue préparée de 10 mL (étape 2.7.2). Après avoir retiré les matières fécales du tissu intestinal, placez le côlon dans une nouvelle plaque à 6 puits remplie de 0,5 ml d’IMDM stérile.
- Connexion du deux-points à l’appareil
- Prenez le mouchoir, connectez-le soigneusement à l’aiguille de 22 G et faites un lien serré avec les deux fils. À ce stade, il est impératif de maintenir l’orientation correcte du côlon par rapport au flux lumineux (proximal = entrée, distal = sortie). Répétez les étapes 3.2-3.3 pour les 6 tissus.
- Vérifiez que les verrous Luer de l’aiguille d’entrée sont vides du support. Sinon, videz-les. Ajoutez des stimulations à l’aiguille d’entrée Luer lock (pour éviter l’entrée de bulles d’air dans la lumière). Répétez cette étape pour chaque côlon avec la stimulation appropriée.
- Vérifiez que tous les mouchoirs sont connectés et placez le couvercle du couvercle sur le dessus de l’appareil.
- Raccordement de l’appareil de culture d’organes aux pompes
- Placez l’appareil dans la chambre préchauffée à température contrôlée (37 °C).
- Connecter le flux de gaz
- Connectez l’adaptateur de gaz au couvercle du couvercle à l’aide de l’aiguille d’entrée appropriée.
- Connectez les tubes d’entrée et de sortie à l’appareil.
note: Connectez le côté proximal du côlon aux bacs d’entrée.
- Purgez la lumière avec les entrées de stimulation.
- Faites circuler doucement la stimulation luminale à travers l’intestin et vérifiez le débit du fluide dans les tubes de sortie.
- Laver le support externe.
- Lavez le fluide externe 3 fois (réglez les pompes à un débit de 600 μL/min pour bien l’entrée et la sortie). Chaque lavage dure 1 minute (en commençant par vider le puits).
- Démarrez l’expérience.
- Démarrez les pompes aux débits suivants :
Débit : lumen : entrée 30 μL/h, sortie 35 μL/h
Milieu externe : entrée - 1000 μL/h, sortie - 950 μL/h
note: La durée de l’expérience peut varier entre 30 min et 24 h.
- Fin de l’expérience (jusqu’à 24 h pour les cultures d’organes du côlon)
- Débranchez tous les tubes de l’appareil.
- Débranchez les tissus des aiguilles et continuez jusqu’aux lectures souhaitées.
