Analyse de l’effet des préparations de produits du tabac sur la production de cytokines par coloration intracellulaire et cytométrie en flux

Résumé

Source : Arimilli, S. et al., Méthodes d’évaluation de la cytotoxicité et de l’immunosuppression des préparations de produits du tabac combustibles.J. Vis. Exp.(2015)

Cette vidéo démontre l’effet des préparations de produits du tabac, les TPP, sur la production de cytokines à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’aide de la cytométrie en flux. Le traitement des cellules avec le TPP régule à la baisse la production de cytokines pro-inflammatoires, qui est estimée après stimulation par lipopolysaccharides, suivie d’une immunocoloration et d’une analyse par cytométrie en flux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Préparation WS-CM

1. Générer un milieu entier conditionné à la fumée (WS-CM) comme décrit précédemment.
   1. Préparez WS-CM en faisant passer la fumée de quatre cigarettes de référence 3R4F dans un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sans rouge de phénol en utilisant le schéma de fumage suivant : 35-60-2, volume de la bouffée en ml, interval....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 X 75 tubes	BD Faucon	352058
Tubes coniques de 15 ml	Corning	Référence 430790
Microtubes de 2 ml	Axygen	MCT-150-C-S
Cigarettes de référence 3R4F	Université du Kentucky, Collège d’agriculture	3R4F
Tubes coniques de 50 ml	Corning	430828
Flacon de 500 ml	Corning	430282
Plaque à fond plat à 96 puits	Termo Nunc	439454
Hotte de culture cellulaire	Thermo Scientific	Série 1300 A2
centrifugeuse	Eppendorf	Référence 58110R
Cytofix/Cytoperm (Permwash)	BD Biosciences	555028	inflammable
FBS	Sigma-Aldrich	Réf. F2442
Unité de filtration	Nalgene	Référence 156-4020
Cytomètre en flux	BD Biosciences	FACS Canto II	8 couleurs, chez Ex 405 et Em785.
Cytomètre en flux	BD Biosciences	FACS Calibur	4 couleurs chez Ex 495 et Em 785.
Logiciel d’analyse de cytométrie en flux	Étoile d’arbre	FlowJo
Conteneur de congélation	Nalgene	Référence 5100-0001	Contient du DMSO, irritant
GogliPlug	BD Biosciences	555029	Cancérigène, irritant, corrosif
Anticorps IFN-γ V-500	BD Horizon	Référence 561980	sensibilisant cutané
Tampon d’isolement	Isolymphe, CTL Scientific Corp.	1114868	Liquide inflammable, irritant
Alcool isopropylique	Sigma-Aldrich	W292907
L-Glutamine	Gibco Life Technologies	Référence 25030-081
Lps	Sigma-Aldrich	L2630
Anticorps MIP1-α PE	BD Pharmingen	Référence 554730	Toxicité aiguë, orale
nicotine	Sigma-Aldrich	N° N3876	Toxicité aiguë, Danger pour l’environnement
Parafilm	Bemis	« M »
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	Réf. P6148	Inflammable, Irritation cutanée
Enclos/streptocoque	Gibco Life Technologies	Référence 15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologies	Référence 11875-093
Tampon en cours d’exécution	Tampon de fonctionnement MACS, Miltenyi Biotech	Tél. : 130-091-221
Anticorps TNF-α Alexa Fluor 488	BioLégende	502915
Pipette de transfert	Fisher Scientific	Tél. : 13-711-20