Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Préparation WS-CM
- Générer un milieu entier conditionné à la fumée (WS-CM) comme décrit précédemment.
- Préparez WS-CM en faisant passer la fumée de quatre cigarettes de référence 3R4F dans un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sans rouge de phénol en utilisant le schéma de fumage suivant : 35-60-2, volume de la bouffée en ml, intervalle de bouffée en secondes et durée de la bouffée en secondes, respectivement. Chaque préparation génère un échantillon de 20 ml.
- Étiquetez le(s) tube(s) avec la date, l’heure de la fin du match, le nom et le numéro de la cigarette. Stockez les aliquotes de 500 μl à -80 °C immédiatement après la fin du fumage.
- Analyser des aliquotes de WS-CM congelés pour déterminer les niveaux de nicotine, de nitrosamines spécifiques au tabac et d’hydrocarbures aromatiques polycycliques tels que décrits précédemment.
2. Isolement des cellules mononucléées du sang périphérique, PBMC
- Prélever du sang frais de donneurs sains (qui ne sont pas des consommateurs de produits du tabac) Isoler les PBMC du sang frais comme décrit ci-dessous.
- Avant l'arrivée de la poche de sang, préparez une bouteille de 500 ml, des ciseaux, un tampon d'isolement et une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) (RT) de Dulbecco dans une hotte de culture cellulaire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Le tampon d’isolement doit être protégé de la lumière.
- Tenez la poche de sang à l’envers et coupez le tube juste en dessous de l’endroit où elle a été serrée en laissant au moins 3 cm de tube.
- Retirez le bouchon du flacon de 500 ml et maintenez le tube au-dessus de l’ouverture du flacon. Prenez la poche de sang et retournez-la pour permettre au sang de s’écouler librement de la poche dans la bouteille jusqu’à ce que la poche soit vide. Laissez le sang s’écouler sur la paroi intérieure de la bouteille plutôt que vers le bas pour éviter de créer des bulles.
- Versez le tampon d’isolement dans la bouteille à un rapport de 1:5 entre le tampon d’isolement et le sang. Fermez bien la bouteille et retournez-la doucement, bout à bout, 10 fois. Laissez le flacon dans la hotte de culture cellulaire pour incuber avec les lumières éteintes, pendant 1 heure à RT.
- Une légère couche de couleur paille s’accumulera au-dessus du sang. Prélever cette couche à l’aide d’une pipette sérologique de 25 ml dans des tubes coniques de 50 ml. La quantité collectée peut varier de 50 à 300 ml, selon le sujet qui a donné son sang.
- Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 10 min à RT.
- Aspirez le surnageant translucide, laissant la pastille de couleur sang foncé. Le granulé sera lâche mais visqueux.
- Pipeter 3 ml de tampon d’isolement dans des tubes coniques de 15 ml.
- À la pastille remise en suspension, ajouter 20 ml de DPBS pour 50 ml de liquide de couleur paille recueilli à l’étape 2.1.5. Vortex pour bien mélanger et consolider le liquide en suspension de plusieurs tubes. Ce liquide contient des cellules sanguines en suspension.
- À l’aide d’une pipette de transfert, transférez 5 ml des cellules sanguines en suspension sur 3 ml de tampon d’isolement à l’étape 2.1.8. Inclinez lentement et doucement le tube conique de 15 ml qui contient la suspension cellulaire pour créer deux couches distinctes. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 40 min à RT avec une accélération minimale et sans frein.
- À l’aide d’une pipette de transfert, la couche intermédiaire trouble résultante (couche leucocytaire) contenant des PBMC dans un tube conique de 50 ml. Évitez de dessiner d’autres couches transparentes en dessous. Ne transvasez pas plus de 25 ml dans chaque tube conique de 50 ml.
- Ajoutez 25 ml de tampon de coulée à froid (ou plus pour remplir tout le volume restant du tube conique de 50 ml) pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Remettez la pastille en suspension avec 10 ml de tampon de coulée. Comptez les cellules et utilisez-les immédiatement ou placez-les sur de la glace pour les congeler.
3. Congélation et décongélation des PBMC
- Centrifuger les cellules mononucléées du sang ériphéral (PBMC) qui ont été prélevées à l’étape 2.1.13 pendant 10 min à 400 x g.
- Remplissez le récipient de congélation avec de l'alcool isopropylique conformément aux instructions du fabricant.
prudence: L’alcool isopropylique est inflammable et extrêmement toxique.
- Remettre la pastille en suspension avec un milieu RPMI 1640 (4 °C) contenant 20 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Il s’agit d’un moyen de congélation RPMI 1640. Remettez le granulé en suspension avec une quantité de fluide de congélation qui donnera une suspension d’environ 5 x 107 cellules/ml. Le nombre de cellules disponibles pour la congélation varie.
- Versez 1 ml d’aliquotes de suspension cellulaire dans des cryotubes de 2 ml et placez les cryotubes dans le récipient de congélation. Placez le récipient de congélation avec les cryotubes dans un congélateur à -80 °C pour stocker O/N, puis retirez les cryotubes et transférez-les pour les stocker dans un congélateur cryogénique entre -150 °C et -190 °C.
- Retirez le cryotube du stockage cryogénique et décongelez-le rapidement en l’agitant doucement dans un bain-marie à 37 °C.
- Transférez immédiatement les PBMC décongelés dans le cryotube dans un tube conique de 15 ml avec 10 ml de milieu complet RPMI 1640 (4 °C) contenant 10 % de FBS, 1 % de Pen/Strep et 1 % de L-glutamine. Le contenu du cryotube décongelé doit être transféré dès que possible pour obtenir une viabilité cellulaire maximale.
- Centrifuger les PBMC à 400 x g pendant 10 min.
- Remettez le granulé en suspension avec 5 ml de milieu complet RPMI 1640 et comptez les cellules.
- Mesurer la viabilité cellulaire à l’aide de méthodes établies telles que la méthode d’exclusion du bleu de trypan. En général, la viabilité cellulaire avec cette méthode est d’environ 90 à 95 %. Les PBMC sont maintenant prêts à être utilisés dans des expériences.
4. Coloration intracellulaire et cytométrie en flux
REMARQUE : Les dilutions énumérées ici sont pour les besoins de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustées en conséquence.
- Diluer le WS-CM dans une plaque à 96 puits à l’aide d’un milieu complet RPMI jusqu’à un volume total de 100 μl/puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 μg/ml d’unités d’équinicotine.
- Dans la même plaque, diluer la nicotine aux concentrations suivantes : 2, 10, 50, 100, 500, 2000 et 4000 μg/ml.
prudence: La nicotine est extrêmement toxique et dangereuse pour l’environnement.
- Ajouter 100 μl de PBMC en suspension dans un milieu complet RPMI à une concentration de 1 × 106 cellules/puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou nicotine sera de 200 μl/puits.
- Couvrir la plaque et laisser incuber pendant 3 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Lavez les cellules à RT en centrifugeant à 300 × g pendant 3 min, en aspirant le surnageant, en faisant tourbillonner le fond de la plaque avec la plaque recouverte et enfin en remettant les cellules en suspension avec 200 μl de tampon de coulée glacé, et répétez l’étape de lavage une fois de plus.
- Ajoutez 200 μl de milieu complet RPMI dans la plaque et répétez l’étape de lavage une fois de plus.
- Préparez les concentrations de travail de 2 μl/ml GolgiPlug et de 10 μg/ml de LPS à l’aide du milieu complet RPMI et ajoutez 200 μl dans chaque puits.
- Incuber la plaque pendant 6 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- À la fin de l’étape 9.8, lavez les cellules avec un tampon courant (4 °C) et essorez-les à 300 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Ajouter 100 μl de Cytofix dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 4 °C.
- Lavez les cellules 3 fois comme décrit à l’étape 9.9 avec 1x Permwash (4 °C) à 300 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Ajouter 45 μL de 1x Cytoperm dans chaque puits, suivis de 5 μL de chacun des anticorps suivants dans chaque puits : TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incuber à 4 °C pendant 30 min.
- Lavez les cellules deux fois comme décrit à l’étape 9.9 avec 1x Permwash (4 °C) et une fois avec un tampon de coulée (4 °C) à 300 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Remettre les cellules en suspension avec 200 μl de paraformaldéhyde à 2 % (4 °C). Transférez les cellules dans des tubes de 12 × 75 mm et analysez les échantillons sur un cytomètre en flux.
prudence: Le paraformaldéhyde est corrosif, extrêmement toxique et dangereux pour la santé.
