Synthèse in vitro de biofilm par Staphylococcus aureus

Résumé

Source : Rana, P. S. et al., Tests in vitro normalisés pour visualiser et quantifier les interactions entre les neutrophiles humains et les biofilms de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation d’un biofilm in vitro par S. aureus dans une plaque multipuits recouverte de poly-L-Lysine. La plaque formée d’un biofilm peut être utilisée pour des expériences en aval.

Protocole

1. Préparation du biofilm in vitro

1. Obtenir des colonies isolées de S. aureus à partir d’un stock cryoconservé en utilisant une technique de plaque striée sur une plaque de gélose riche en nutriments, comme la gélose tryptique de soja (voir le tableau des matériaux).
2. Enduire les puits individuels d’une plaque de 96 puits avec 100 μL de poly-L-lysine (PLL) à 0,001 % (v/v) diluée dans du H₂O stérile et incuber à température ambiante pendant 30 min. Aseptiquement, aspirer la solution PLL à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par vide. Laissez les puits sécher toute la nuit à température ambiante.
   note: Toutes les étapes d’aspiration du protocole sont effectuées à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par le vide, sauf indication contraire.
3. Préparez une culture de nuit en inoculant une colonie de S. aureus dans un milieu essentiel alpha minimal (MEMα) complété par 2 % de glucose et incubez à 37 °C, en agitant à 200 tr/min pendant 16 à 18 h.
4. Diluer la culture de nuit en transférant 50 μL à 5 mL de MEMα frais complété par 2 % de glucose et incuber à 37 °C, en agitant à 200 tr/min, jusqu’à la phase logarithmique médiane, généralement entre une densité optique de 600 (OD_{600 nm}) de 0,5 à 0,8. Utilisez MEMα pour normaliser la culture mi-logarithmique à une DO_{de 600 nm} de 0,1.
5. Transvaser 150 μL de culture normalisée dans chaque puits de la plaque de 96 puits traitée par la LPL. Incuber statiquement pendant 18-20 h dans une chambre humidifiée à 37 °C.
   note: Les biofilms peuvent également être cultivés dans d’autres formats tels que des lames à μ canaux (voir le tableau des matériaux).
6. Aspirer le surnageant pour éliminer les cellules planctoniques. Lavez délicatement la biomasse restante avec 150 μL de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pour éliminer les cellules détachées. Ajouter HBSS goutte à goutte pour éviter de perturber le biofilm.
   note: Lors de l’aspiration du surnageant et du HBSS pendant les lavages, laissez juste assez de liquide (surnageant ou HBSS) dans les puits contenant le biofilm pour que le biofilm soit toujours immergé. Cela permet d’éviter la rupture de la structure du biofilm lorsque le HBSS est ajouté goutte à goutte pour laver le biofilm.
7. Répétez l’étape 1.6 au moins deux fois de plus pour éliminer toutes les cellules planctoniques. À ce stade, les biofilms sont prêts pour des expériences en aval immédiates.
   note: Si les biofilms ne sont pas utilisés pour des expériences sur les neutrophiles, le HBSS peut être remplacé par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Le HBSS est préféré au PBS car il contient des composants, dont le glucose, qui fournissent des conditions optimales pour l’activation des neutrophiles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD Bacto Tryptic Bouillon de Soja	Bd	Référence : DF0370-07-5	Combinez avec 1,5 % d’agar pour faire de la gélose tryptique de soja
Plaques de polystyrène à fond plat transparent de 96 puits	Costar	Référence 3370
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	Référence 21-022-CV	Sans calcium, magnésium et rouge de phénol
Solution de poly-L-lysine	sigma	P4707-50ML
Plaques blanches opaques de 96 puits	Faucon	353296	Plaque traitée pour culture tissulaire et à fond plat
Média essentiel minimal (MEM) Alpha 1x	Gibco	Référence 41061-029