1. Préparation antigénique
REMARQUE : Trois préparations antigéniques différentes peuvent être utilisées pour évaluer la réponse immunitaire à Hi. Il s’agit de 1) un composant subcellulaire (généralement de la paroi cellulaire bactérienne) ; 2) les bactéries tuées et inactivées ; et 3) les bactéries vivantes. Déterminer l’utilisation de chaque préparation antigénique avant le début de toute expérience.
- Composants subcellulaires
- Obtenez des composants subcellulaires à partir de sources, y compris des préparations commerciales, des composants développés en interne et/ou d’autres chercheurs.
note: Des composants subcellulaires, généralement issus de la paroi cellulaire bactérienne, peuvent être utilisés, notamment des protéines de la membrane externe telles que P6 et le lipooligosaccharide (LOS). Ces composants subcellulaires sont généralement dérivés dans des centres spécialisés. La description de la façon dont ils sont fabriqués dépasse le cadre de cet article. Il est recommandé de contacter directement des experts dans ce domaine pour obtenir ces composants.
- Bactéries tuées/inactivées
- Prélevez la bactérie à partir de l’échantillon approprié (p. ex. expectoration ou bronchoscopie). Confirmer que la souche est H. influenzae à l’aide d’un laboratoire de microbiologie approprié. Effectuer le typage des échantillons de H. influenzae pour confirmer qu’ils ne sont pas typables (NTHi, par un laboratoire de microbiologie spécialisé).
- Pour obtenir un antigène représentatif, utilisez plusieurs souches de NTHi (au moins 5, chacune d’environ la même quantité) pour fabriquer un antigène combiné. Conservez les souches à -70 °C dans un bouillon de glycérol dans des tubes de microcentrifugation.
note: Dans cette expérience, dix souches distinctes ont été utilisées.
- Décongelez les souches (un tube de microcentrifugation à la fois) sur des plaques de gélose au chocolat et cultivez-les pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2. Ajoutez les bactéries à 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et lavez-les deux fois (essorage à 300 x g pendant 5 min). À l’aide d’un étalon MacFarland ou d’un spectrophotomètre, on aliquote NTHi à une concentration de 10 à8 mL (à l’aide d’un contenant de 5 mL ou l’équivalent).
- La chaleur inactive les bactéries en les plaçant dans un bain-marie à une température de 56 °C pendant 10 min.
- Sonicez les bactéries à l’aide d’un réglage de sonication continu à une vitesse faible à moyenne pendant 30 secondes.
- Aliquote le volume approprié d’échantillons dans des tubes de microcentrifugation. Pour un échantillon de 10 à8 mL, utiliser des aliquotes de 50 μL (c.-à-d. 20 échantillons par mL) et les congeler à -70 °C jusqu’à ce que vous ayez besoin.
- Bactéries vivantes
- Tout d’abord, caractérisez les bactéries vivantes comme mentionné à l’étape 1.2.1. Utilisez une souche bien caractérisée. Assurez-vous que la souche est également stockée dans un bouillon de glycérol à -70 °C en réserve.
- Cultivez les bactéries sur des milieux enrichis tels que des assiettes de gélose au chocolat ou dans du bouillon.
- Pour utiliser des plaques de gélose au chocolat, étalez les bactéries au moins tous les 3-4 jours avec des épandeurs stériles.
- Alternativement, utilisez un bouillon d’infusion Brain Heart (BHI) enrichi en facteurs X (hémine) et V (β-nicotinamide adénine dinucléotide) pour faire croître la bactérie. Inoculer NTHi à partir de boîtes de nuit dans 5 à 10 ml de bouillon BHI complété par de l’hémine et du β-nicotinamide adénine dinucléotide (10 μg/mL chacun) et cultiver pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2.
note: Cela présente l’avantage de la reproductibilité, d’un nombre plus élevé d’unités formant colonies (UFC) et du fait que toutes les bactéries se trouvent à une phase similaire de croissance logarithmique (sur les plaques, la viabilité bactérienne peut être plus grande selon la position dans la culture).
- Utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 100 bactéries dans une cellule pour susciter une forte réponse immunitaire tout en maintenant la viabilité cellulaire. Utilisez l’étalon MacFarland ou un spectrophotomètre pour évaluer le nombre de bactéries.
- Assurez-vous que le milieu utilisé pour les tests de NTHi vivants est exempt de sérum humain, car cela tuera les bactéries. Les échantillons de sérum d’animal (p. ex., sérum de veau fœtal) ne posent généralement aucun problème.
note: Utilisez les méthodes décrites ci-dessous pour analyser des échantillons de tissus standard tels que du sang périphérique, des échantillons de bronchoscopie (en particulier le lavage broncho-alvéolaire (BAL)) et du tissu pulmonaire réséqué. Incuber les échantillons avec l’antigène Hi de 10 min à 24 h ou plus.
2. Évaluation de la fonction lymphocytaire dans le sang périphérique
- Utilisez des préparations de sang total ou de cellules mononucléées pour les tests de cytométrie en flux.
- Obtenir des échantillons de chaque sujet par ponction veineuse. Prélever 4 mL de sang d’une veine périphérique dans un tube d’héparine de lithium et diviser les échantillons en aliquotes pour le contrôle et la stimulation antigénique.
- Ajouter des anticorps costimulateurs (anti-CD28 et CD49d, 1 μL/mL) aux deux échantillons. Ajouter NTHi à l’échantillon d’antigène et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 h. Pour la préparation de NTHi tuée, ajouter 200 μL de l’antigène à 2 mL de sang. Pour les NTHi vivants, ajoutez des cellules NTHi vivantes à un moment d’inertie de 100:1 aux globules blancs (mesurés par hémocytomètre).
- Ajouter l’agent bloquant Golgi Brefeldin A (10 μL/mL) aux échantillons et les incuber pendant 5 h.
note: Le blocage de l’appareil de Golgi empêche les cytokines d’être exportées à l’extérieur de la cellule.
- Si du sang total est utilisé, lyser les érythrocytes avec du chlorure d’ammonium à 0,8 % pour ne laisser que les leucocytes en solution. Fixez les leucocytes à l’aide de 500 μL de paraformaldéhyde à 1 % à 2 % pendant 1 h.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, perméabilisez 10 cellules 6 avec 100 μL de saponine à 0,1 % pendant 15 min, et incubez les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence. Laver les cellules et les analyser à l’aide d’un cytomètre en flux.
note: La quantité d’anticorps marqués par fluorescence sera spécifique pour chaque cytokine. Suivez les instructions du fabricant. En règle générale, 10 à6 cellules dans 100 μL de solution seront colorées pendant 1 h. La plupart des anticorps obtenus dans le commerce seront suffisants pour effectuer 25 à 100 tests.
- Déterminez la proportion de cellules répondantes à l’antigène en tenant compte de la population lymphocytaire pertinente (les cellules sont contrôlées par CD45, puis par CD3, et plus tard par l’expression de CD4 ou CD8) comme le montre la figure 1. Effectuer une coloration de fond sur des cellules non stimulées pour l’ensemble des cytokines à analyser. Passez au crible 100 000 cellules pour analyser chaque cytokine à la recherche de cellules stimulées et de cellules témoins.
