Quantification des médiateurs inflammatoires dans des cellules dérivées de tissus humains infectés

Abstract

Source : Dousha, L. et al., Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae.J. Vis. Exp.(2021)

Cette vidéo démontre la quantification des médiateurs inflammatoires au cours de l’infection en incubant des cellules immunitaires dérivées de tissus pulmonaires humains avec Haemophilus influenzae. La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer la fluorescence des cytokines dans les lymphocytes marqués, en corrélation avec la production de cytokines pro-inflammatoires en réponse à une infection bactérienne.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.

1. Préparation antigénique

1. Bactéries vivantes
   1. Tout d’abord, caractérisez les bactéries vivantes. Prélevez la bactérie à partir de l’échantillon approprié (p. ex. expectoration ou bronchoscopie). Confirmez que la souche est Haemophilus influenzae à l’aide d’un laboratoire de microbiologie approprié. Effectuer le typage des échantillons de H. influenzae pour confirmer qu’ils ne sont pas typables (par un laboratoire de microbiologie spécialisé). Utilisez une souche bien caractérisée. Assurez-vous que la souche est également stockée dans un bouillon de glycérol à -70 °C en réserve.
   2. Cultivez les bactéries sur des milieux enrichis tels que des assiettes de gélose au chocolat ou dans du bouillon.
      1. Pour utiliser des plaques de gélose au chocolat, étalez les bactéries au moins tous les 3-4 jours avec des épandeurs stériles.
      2. Alternativement, utilisez un bouillon d’infusion Brain Heart (BHI) enrichi en facteurs X (hémine) et V (β-nicotinamide adénine dinucléotide) pour faire croître la bactérie. Inoculer H. influenzae non typable (NTHi) à partir de plaques de nuit dans 5 à 10 mL de bouillon BHI complété par de l’hémine et de l’adénine dinucléotide de β-nicotinamide (10 μg/mL chacun) et cultiver pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5 % de CO₂.
         note: Cela présente l’avantage de la reproductibilité, d’un nombre plus élevé d’unités formant colonies (UFC) et du fait que toutes les bactéries se trouvent à une phase similaire de croissance logarithmique (sur les plaques, la viabilité bactérienne peut être plus grande selon la position dans la culture).
   3. Utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 100 bactéries dans une cellule pour susciter une forte réponse immunitaire tout en maintenant la viabilité cellulaire. Utilisez l’étalon MacFarland ou un spectrophotomètre pour évaluer le nombre de bactéries.
   4. Assurez-vous que le milieu utilisé pour les tests de NTHi vivants est exempt de sérum humain, car cela tuera les bactéries. Les échantillons de sérum d’animaux (p. ex., sérum de veau fœtal) ne posent généralement aucun problème.
      REMARQUE : Utilisez les méthodes décrites ci-dessous pour analyser des échantillons de tissus standard tels que du sang périphérique, des échantillons de bronchoscopie (en particulier le lavage broncho-alvéolaire (BAL)) et du tissu pulmonaire réséqué. Incuber les échantillons avec l’antigène Hi de 10 min à 24 h ou plus.

2. Évaluation de la fonction lymphocytaire/médiateurs inflammatoires dans le tissu pulmonaire

1. Il n’est généralement pas possible d’obtenir suffisamment de lymphocytes à partir de la bronchoscopie ; par conséquent, utilisez le tissu pulmonaire à partir d’échantillons de lobectomie. L’optimisation des échantillons de tissus pulmonaires nécessite une liaison étroite avec le service d’anatomopathologie. Assurez-vous que le tissu a une marge d’au moins 3 cm de la tumeur et qu’il s’agit du tissu cellulaire sans emphysème significatif (tel que déterminé par le pathologiste).
2. Cassez le tissu pulmonaire en une suspension cellulaire avant de pouvoir l’utiliser pour des tests de cytométrie en flux. Digérer le tissu pulmonaire chimiquement (par exemple, avec la collagénase) ou le désagréger mécaniquement.
   note: La désagrégation mécanique des tissus peut être préférée car elle est associée à une meilleure coloration de surface des cellules (par exemple, marquage CD3/4).
   1. Obtenez des échantillons de lobectomie auprès d’un pathologiste (généralement obtenus chez des patients subissant un traitement contre le cancer du poumon). Coupez environ 20 à 40 g de l’échantillon en^sections de 3 à 5 mm. Placez-les à l’intérieur d’une chambre stérile de 50 μL avant d’être fragmentés mécaniquement à l’aide d’un désagrégateur approprié.
   2. Après désagrégation tissulaire, lyser les érythrocytes avec 10:1 (c’est-à-dire 5 ml) de chlorure d’ammonium à 0,8 % (150 mM de chlorure d’ammonium (NH₄Cl), 1 mM de bicarbonate de sodium (NaHCO₃) et une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,1 mM.
      note: Alternativement, un système automatisé tel que Q-prep peut être utilisé.
   3. Remettre les cellules en suspension dans du RPMI stérile (le volume dépendra du nombre de cellules et est généralement de 10 à 20 ml), puis filtrez-les à travers un treillis en nylon stérile de 100 μm. Comptez le nombre de cellules viables à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan.

3. Essai d’infection NTHi

1. Remettre les cellules pulmonaires en suspension jusqu’à une concentration cellulaire finale de 4 x 10⁶ cellules/mL par tube (échantillons témoins et stimulés).
2. Utilisez une suspension de 4 x 10^6-6 x 10⁶ cellules dans 1 mL de RPMI pour le tube de contrôle (négatif). Utiliser la même quantité pour le tube NTHi (tout échantillon supplémentaire peut être utilisé comme témoin positif avec le superantigène staphylococcique E (SEB). Infecter les cellules du tube NTHi à un moment d’inertie de 100 bactéries par cellule. Desserrez le capuchon d’une demi-rotation pour permettre le transfert de gaz dans les tubes.
3. Placez les cellules dans un rotateur de tube et incubez-les à 37 °C tout en tournant à 12 tr/min.
4. Pour empêcher l’exportation extracellulaire de cytokines, ajouter un bloqueur de Golgi (Brefeldin A) aux suspensions cellulaires 1 h après la stimulation jusqu’à une concentration finale de 10 μg/mL. Retournez les suspensions cellulaires pour une autre incubation de 16 à 22 h en rotation.
5. Laver la suspension cellulaire avec 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,01 % d’azoture de sodium, NaN₃.
6. Ajouter les anticorps pour la coloration intracellulaire des cytokines (le choix des anticorps doit être déterminé par l’investigateur). Colorer la suspension cellulaire pour des marqueurs spécifiques de surface cellulaire des lymphocytes humains (par exemple, CD45, CD3, etc.) pendant 1 h. Lavez les cellules avec du PBS, fixez-les et perméabilisez-les.
7. Fixez les cellules à l’aide de 500 μL de paraformaldéhyde à 2 % pendant 1 h.
8. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, perméabilisez 10 cellules 6 avec 100 μL de saponine à 0,1 % pendant 15 min, et incubez les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence. Laver les cellules et les analyser à l’aide d’un cytomètre en flux.
   note: La quantité d’anticorps marqués par fluorescence sera spécifique pour chaque cytokine. Suivez les instructions du fabricant. En règle générale, 10 à⁶ cellules dans 100 μL de solution seront colorées pendant 1 h. La plupart des anticorps obtenus dans le commerce seront suffisants pour effectuer 25 à 100 tests.
9. Incuber les cellules avec des anticorps de coloration des cytokines intracellulaires (par exemple, interféron-gamma, IFN-γ et facteur de nécrose tumorale bêta, TNF-α ou interleukine, IL-13 et IL-17A) pendant 1 h.
   note: Il est recommandé de colorer d’abord les marqueurs de surface, puis intracellulaires, car la fixation peut provoquer des changements conformationnels dans les protéines de surface auxquelles les anticorps se lient.
10. Laver les cellules avec 500 μL de PBS et les remettre en suspension dans 100 μL de PBS avant l’acquisition des données sur un cytomètre en flux.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorure d’ammonium	Sigma Aldrich	Référence 213330
Brefeldin	Sigma Aldrich	Réf. B6542
Maille en nylon stérile Filcon	Becton Dickinson	340606
Substrat gélatiné, Enzchek	Sondes moléculaires	E12055
Rotateur de tube de mixage MACS	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-090-753
Médimachine	Becton Dickinson		Numéro de catalogue non disponible
saponine	Sigma Aldrich	8047152