Détermination de la production de ROS par les neutrophiles lors de l’interaction avec un biofilm opsonisé

Résumé

Source : Rana, P. S. J. B., et al. Essais in vitro standardisés pour visualiser et quantifier les interactions entre les neutrophiles humains et les biofilms de staphylocoque doré. J. Vis. Exp. (2022)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test de chimiluminescence in vitro pour détecter la génération d’espèces réactives de l’oxygène par les neutrophiles lors de l’exposition à un biofilm bactérien opsonisé.

Protocole

1. Mesure des ROS produites par les neutrophiles

1. Ajouter 100 μL de sérum humain normal à 20 % (dilué dans HBSS) goutte à goutte dans le biofilm lavé et incuber à 37 °C dans des conditions statiques pendant 30 min pour opsoniser le biofilm.
2. Aspirez la solution sérique à 20 % et lavez les biofilms goutte à goutte avec 150 μL de HBSS une fois. Aspirer le HBSS, en laissant derrière soi des puits avec des biofilms opsonisés.
   note: Pour l’interprétation de l’expérience, un minimum de quatre groupes est recommandé : (A) Neutrophiles + Biofilm, (B) Neutrophiles + PMA (contrôle positif, voir Tableau des matériaux), (C) Neutrophiles uniquement, et (D) Biofilm uniquement.
3. Ajouter du luminol (voir le Tableau des matériaux) aux neutrophiles remis en suspension dans le HBSS à une concentration de 4 x 10⁶ cellules/mL de sorte que la concentration finale de luminol soit de 50 μM. Cette solution est prête à l’emploi pour les groupes (A) et (C). Ajouter 4 x 10⁵ neutrophiles mélangés à du luminol dans les puits avec des biofilms opsonisés.
4. Dans un tube séparé, préparez une solution de luminol de 50 μM dans du HBSS sans aucun neutrophile et ajoutez-la au biofilm contenant bien (groupe D).
5. Aliquote 350 μL de neutrophiles mélangés à du luminol et ajouter du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) à une concentration finale de 500 ng/mL au mélange. Pour le groupe (B), ajoutez 4 x 10⁵ neutrophiles de ce mélange dans des puits sans biofilm. Il s’agit d’un contrôle positif.
   note: La concentration de PMA indiquée dans cette étape est relativement élevée pour assurer une réponse en rafale robuste, car les neutrophiles stimulés par la PMA sont un contrôle positif. La PMA peut être utilisée à une concentration plus faible pour activer les neutrophiles, selon l’expérience.
6. Centrifuger la plaque à 270 x g pendant 30 s à 4 °C.
7. Assurez-vous que le lecteur de plaques est réglé sur 37 °C en même temps que le réglage de la luminescence et de la lecture cinétique pendant 60 minutes avec des intervalles de 3 minutes. Placez la plaque dans le lecteur de plaques pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles pendant 60 min.
   note: Pour cet essai, des biofilms ont été cultivés dans des plaques blanches utilisées pour les tests de luminescence. Le PMA est un agoniste connu de la réponse oxydative en rafale. Lors de la réalisation d’études portant sur la PMA, assurez-vous que la PMA est ajoutée à la dernière étape pendant que la solution contenant des neutrophiles est froide, car la PMA déclenche immédiatement la réponse en rafale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes à centrifuger coniques de 50 mL	Thermo Scientific	339652
Tampon d’alcool	Bd		Utilisé pour la prise de sang
Compteur de cellules	Bal Supply	202C
Plaques de polystyrène à fond plat transparent de 96 puits	Costar	Référence 3370
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) 1x	Gibco	Référence 14190 à 144
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	Référence 21-022-CV	Sans calcium, magnésium et rouge de phénol
Hémocytomètre	Ligne lumineuse
Luminol	sigma	A8511-5G
Média essentiel minimal (MEM) Alpha 1x	Gibco	Référence 41061-029
Sérum humain normal	Technologie du complément	Nhs
Boîte de Pétri (100 x 15 mm)	VWR	Référence 25384 à 342
Phorbol 12-myristate 13-acétate
Solution de poly-L-lysine	sigma	P4707-50ML
Logiciel SoftMax Pro	Dispositifs moléculaires		Logiciel de lecture de microplaques utilisé pour l’acquisition de données
SpectraMax i3x	Dispositifs moléculaires		Lecteur de microplaques