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1. Préparation du biofilm in vitro
- Obtenir des colonies isolées de S. aureus à partir d’un stock cryoconservé en utilisant une technique de plaque striée sur une plaque de gélose riche en nutriments, comme la gélose tryptique de soja (voir le tableau des matériaux).
- Enduire les puits individuels d’une plaque de 96 puits avec 100 μL de poly-L-lysine (PLL) à 0,001 % (v/v) diluée dans du H2O stérile et incuber à température ambiante pendant 30 min. Aseptiquement, aspirer la solution PLL à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par vide. Laissez les puits sécher toute la nuit à température ambiante.
note: Toutes les étapes d’aspiration du protocole sont effectuées à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par le vide, sauf indication contraire.
- Préparez une culture de nuit en inoculant une colonie de S. aureus dans un milieu essentiel alpha minimal (MEMα) complété par 2 % de glucose et incubez à 37 °C, en agitant à 200 tr/min pendant 16 à 18 h.
- Diluer la culture pendant la nuit en transférant 50 μL à 5 mL de MEMα frais supplémenté avec 2 % de glucose et incuber à 37 °C, en agitant à 200 tr/min, jusqu’à la phase logarithmique moyenne, généralement entre une densité optique de 600 (DO600nm) de 0,5 à 0,8. Utilisez MEMα pour normaliser la culture logarithmique moyenne à une DOde 600nm de 0,1.
- Transvaser 150 μL de culture normalisée dans chaque puits de la plaque de 96 puits traitée par la LPL. Incuber statiquement pendant 18-20 h dans une chambre humidifiée à 37 °C.
note: Les biofilms peuvent également être cultivés dans d’autres formats tels que des lames à μ canaux (voir le tableau des matériaux).
- Aspirer le surnageant pour éliminer les cellules planctoniques. Lavez délicatement la biomasse restante avec 150 μL de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pour éliminer les cellules détachées. Ajouter HBSS goutte à goutte pour éviter de perturber le biofilm.
note: Lors de l’aspiration du surnageant et du HBSS pendant les lavages, laissez juste assez de liquide (surnageant ou HBSS) dans les puits contenant le biofilm pour que le biofilm soit toujours immergé. Cela permet d’éviter la rupture de la structure du biofilm lorsque le HBSS est ajouté goutte à goutte pour laver le biofilm.
- Répétez l’étape 1.6 au moins deux fois de plus pour éliminer toutes les cellules planctoniques. À ce stade, les biofilms sont prêts pour des expériences en aval immédiates.
note: Si les biofilms ne sont pas utilisés pour des expériences sur les neutrophiles, le HBSS peut être remplacé par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Le HBSS est préféré au PBS car il contient des composants, dont le glucose, qui fournissent des conditions optimales pour l’activation des neutrophiles.
2. Isolement des neutrophiles
REMARQUE : Les neutrophiles ont été isolés selon une méthode précédemment publiée avec des modifications mineures. Ce protocole d’isolement combine d’abord une centrifugation à gradient de densité, suivie d’une sédimentation à 3 % de dextran. Cette section ne couvre que le protocole global d’isolement des neutrophiles, en se concentrant sur les modifications apportées au protocole publié. De plus, le protocole décrit ci-dessous est l’une des nombreuses méthodes qui permettent d’isoler les neutrophiles et de les remplacer au besoin. D’autres méthodes d’isolement des neutrophiles comprennent l’utilisation de milieux de séparation cellulaire ou la séparation cellulaire par anticorps magnétiques.
- Prélever du sang d’un donneur adulte par ponction veineuse, conformément au protocole décrit dans l’IRB institutionnel. Avant la prise de sang, assurez-vous que la seringue contient suffisamment d’héparine sans conservateur, de sorte que la concentration finale d’héparine soit de 20 U/mL.
- Diluer le sang hépariné avec 3/4 du volume de NaCl 0,9 % sans endotoxines (voir tableau des matériaux) en H2O à température ambiante.
- Pour chaque tranche de 20 mL de l’échantillon de sang dilué, aliquote 14 mL d’un milieu à gradient de densité disponible dans le commerce (voir le Tableau des matières) dans un tube conique frais de 50 mL. Superposez soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le milieu à gradient de densité.
- Centrifuger l’échantillon de sang stratifié à 400 x g pendant 40 min à température ambiante. Assurez-vous que la centrifugeuse a une pause lente pour ne pas perturber la couche une fois la centrifugation terminée.
note: L’échantillon de sang comportera cinq couches contenant un mélange de solution saline et de plasma, une couche de cellules mononucléaires, un milieu à gradient de densité, des neutrophiles et des érythrocytes.
- À l’aide d’une pipette sérologique, aspirer toutes les couches au-dessus des neutrophiles et de la pastille érythrocytaire, puis procéder à une remise en suspension douce de la pastille dans du NaCl froid à 0,9 % sans endotoxines dans H2O. Pour chaque pastille générée à partir d’un échantillon de sang de 20 ml, remettre la pastille en suspension jusqu’à ce qu’elle atteigne un volume total de 20 ml. Ajouter un volume 1:1 de 3 % de dextran (voir le tableau des matériaux). Incuber le tube à la verticale pendant 18-20 min sur ice.
note: Assurez-vous que le dextran à 3 % est fabriqué avec du NaCl à 0,9 % sans endotoxines dansH2O.
- Prélever 20 ml de la couche supérieure qui contient les neutrophiles et certains érythrocytes dans un nouveau tube conique de 50 ml et le centrifuger à 355 x g pendant 10 min à 4 °C. Vider le surnageant en laissant derrière lui une pastille rouge.
- Remettez doucement la pastille en suspension dans 10 mL deH2O froid et stérile pendant 30 secondes pour lyser les érythrocytes restants. Ajouter immédiatement 10 ml de solution saline froide sans endotoxines à 0,9 % au mélange pour restaurer la tonicité. Centrifuger la solution à 233 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Videz le surnageant et remettez en suspension la pastille contenant 95 % à 97 % de neutrophiles dans 1 mL de HBSS froid pour 20 mL de l’échantillon de sang.
- Transférez 10 μL de neutrophiles remis en suspension dans 90 μL de colorant d’exclusion bleu de trypan à 0,4 % et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre (voir le tableau des matériaux).
note: Les cellules non viables sont colorées en bleu car le colorant d’exclusion au bleu de trypan est imperméable dans les cellules viables. Ce protocole assure une viabilité cellulaire de >99 %.
- Ajouter des HBSS supplémentaires de sorte que la concentration finale de neutrophiles soit de 4 x 106 cellules/mL.
note: Dans les cas où la viabilité cellulaire est de <99 %, la concentration finale de 4 x 106 cellules/mL peut encore être atteinte ; cependant, le volume total de solution contenant 4 x 106 cellules/mL obtenu diminuera. La concentration finale de neutrophiles peut être ajustée en fonction des besoins expérimentaux de l'utilisateur. Les neutrophiles ont été remis en suspension à une concentration finale de 4 x 106 cellules/mL pour toutes les expériences décrites ci-dessous. Pour tenir compte de la variabilité d’un donneur à l’autre, il est fortement recommandé que toutes les expériences impliquant des neutrophiles soient réalisées avec au moins trois donneurs différents.
3. Imagerie des interactions biofilm-neutrophiles
- Mettez en place un biofilm en suivant les étapes 1.2 à 1.6. Pour faciliter l’imagerie du biofilm, utilisez une souche fluorescente de S. aureus, telle que USA300 exprimant la protéine fluorescente verte (GFP), afin d’augmenter la facilité d’imagerie microscopique.
note: Une lame à 6 μ canaux (voir le tableau des matériaux) a été utilisée à la place d’une plaque à 96 puits pour démontrer le modèle de biofilm in vitro (étape 1).
- Incuber 4 x 106 cellules/mL de neutrophiles avec 100 μM de colorant Blue CMAC (7-amino-4-chlorométhylcoumarine) (BCD, voir tableau des matériaux) pendant 30 min dans un rocker à 37 °C et 5 % de CO2. Assurez-vous que les échantillons sont incubés dans l’obscurité et limitez l’exposition à la lumière pour les étapes restantes.
- Pour laver l’excès de BCD, centrifugez les neutrophiles à 270 x g pendant 5 min et aspirez le surnageant. Remettre les neutrophiles en suspension dans des HBSS frais. À ce stade, ajoutez de l’homodimère-1 d’éthidium (voir le tableau des matériaux) aux neutrophiles colorés par BCD à une concentration finale de 4 μM pour surveiller la mort des neutrophiles et des bactéries.
- Ajoutez 150 μL de neutrophiles au biofilm de S. aureus qui a été cultivé dans des lames de μ, de sorte que le rapport neutrophiles/bactéries soit de 1:30 (neutrophiles : bactéries). Incuber les lames de μ dans une chambre humidifiée pendant 30 min. Le nombre de cellules bactériennes est basé sur le nombre de cellules obtenu par placage d’un biofilm de 18 h.
- Imager l’interaction neutrophile-biofilm à l’aide de canaux fluorescents correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission des colorants/protéines fluorescents.
note: Pour la présente étude, la BCD est de 353/466 nm, l’homodimère-1 d’éthidium est de 528/617 nm et la GFP est de 395/509 nm. Limitez l’exposition de l’échantillon au laser ou à la lumière pour éviter le photoblanchiment des échantillons.
- Analysez les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images de microscopie ou de programmes tels que FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ et BAIT, parmi bien d’autres.
note: Lorsque vous travaillez avec des colorants, il est important de tenir compte de la spécificité des colorants utilisés. Certaines coloration fonctionnent sur les cellules procaryotes et eucaryotes, tandis que d’autres ne fonctionnent que sur une seule. Si les neutrophiles et les biofilms sont colorés séparément à l’aide de colorants qui peuvent colorer les deux types de cellules, assurez-vous d’éliminer tout colorant restant avant de combiner les neutrophiles et les biofilms pour éviter la coloration croisée.