Évaluation de la colite induite par des produits chimiques par l’analyse immunohistochimique de coupes de tissu du côlon

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des souris et du DSS

1. Conservez les souris knockout (α-gustducin^-/-) et les souris de type sauvage adaptées à l’âge, au sexe et au poids corporel (α--gustducin^+/+) C57BL/6 individuellement dans des cages propres.
   note: Les souris knock-out ont été rétrocroisées avec des souris C57BL/6 pendant plus de 20 générations et ont un patrimoine génétique C57BL/6 de près de 100
 %.
2. Dissoudre 30 g de poudre de sulfate de sodium de dextran (DSS) dans 1 L d’eau autoclave. Mélanger jusqu’à ce que la solution devienne claire pour s’assurer que la concentration finale de travail est de 3 % (p/v).
   note: La solution DSS peut être conservée à température ambiante jusqu’à 1 semaine ou à 4 °C jusqu’à son utilisation.

2. Induction et évaluation de la colite DSS chez la souris

1. Pesez et notez le poids initial du corps de chaque souris. Placez les souris individuellement dans des cages en plastique standard et étiquetez-les.
2. Remplacer l’eau potable ordinaire par une solution de DSS à 3 % pendant un total de 7 jours auxquels les deux groupes de souris ont accès à volonté.
3. Mesurez le poids corporel de la souris, notez la consommation de solution de DSS, et collectez et examinez les selles de chaque souris quotidiennement pendant l'administration de DSS. Observez la gravité de la diarrhée et des saignements rectaux et convertissez-la en indice de maladie induit par le DSS.
4. Au cours de l’expérience, le pourcentage de perte de poids par rapport au poids initial et l’indice de maladie sont calculés pour évaluer les symptômes de la colite.
   note: L’indice de maladie est noté en combinant les observations de diarrhée et de saignement rectal et est défini comme suit : 0 (selles normales, pas de sang), 1 (selles molles, pas de sang), 2 (selles molles, peu de sang), 3 (selles très molles, saignements modestes) et 4 (selles liquides, saignements importants). L’indice de maladie est analysé quotidiennement pour chaque souris.
5. À la fin du traitement DSS de 7 jours, sacrifiez les souris par luxation cervicale et procédez aux expériences restantes.

3. Préparation des échantillons de tissus

1. Placez la souris en position couchée et nettoyez la peau de l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision médiane de 3 cm de long dans l’abdomen avec une paire de petits ciseaux pour exposer la cavité abdominale.
2. À l’aide d’une paire de pinces, séparez soigneusement la rate des autres tissus, puis retirez la rate et mesurez sa taille.
3. Identifiez et soulevez le côlon à l’aide d’une pince et séparez-le du mésentère environnant. Retirez tout le côlon jusqu’à ce que le cæcum et le rectum soient visibles.
4. Isolez le côlon en le transectant à la marge colo-ocèque et profondément dans le bassin pour libérer le côlon proximal et distal, respectivement. Ensuite, mesurez et notez la longueur du côlon isolé. Veillez à ne pas endommager le tissu colique pendant la procédure de dissection.
5. Rincer le côlon avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée à l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille à gavage pour enlever les matières fécales et le sang jusqu’à ce que l’éluat soit complètement clair.
6. Pour l’identification histologique, divisez les échantillons de tissus en trois parties : proximale, moyenne et distale. Ensuite, fixez le tissu avec du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant la nuit à 4 °C.
7. Pour l’analyse de l’expression des cytokines, congelez rapidement l’ensemble du côlon avec de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C jusqu’à l’utilisation.

4. Évaluation histologique de la gravité de la colite induite par le SSD

1. Immunohistochimie
   1. Après la fixation, immergez le tissu dans une solution de 30 % de saccharose dans 1x PBS pendant la nuit dans un tube de 15 mL pour cryoprotéger les échantillons.
   2. Incorporez le tissu dans la pâte à température de coupe optimale (OCT) et placez-le à -20 °C jusqu’à ce que l’OCT durcisse.
   3. Transférez le bloc OCT contenant le tissu dans un cryostat, réglez le cadran d’épaisseur dans le cryostat sur 12 μm, puis coupez et collectez des sections congelées de 12 μm d’épaisseur.
   4. Chauffer les coupes de tissus prélevées dans un cryostat à 65 °C pendant 20 min sur une plaque chauffante. Lavez les sections en 1x PBS 3 fois, pendant 10 min chacune. Incuber les sections de tissu dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 min pour éliminer la peroxydase endogène. Lavez les sections 3 fois de plus. Bloquez les tissus avec un tampon bloquant (3 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,3 % de détergent non ionique, 2 % de sérum de chèvre, 0,1 % d’azoture de sodium dans 1x PBS) à température ambiante pendant 1 h ou plus.
   5. Remplacez le tampon de blocage par une solution contenant les anticorps primaires spécifiques du type de cellule immunitaire suivant : CD45 pour les leucocytes, CD3 pour les lymphocytes T, B220 pour les lymphocytes B, CD11b pour les macrophages et Ly6G pour les neutrophiles. Incuber à 4 °C pendant la nuit.
   6. Retirer les anticorps primaires des coupes de tissus par aspiration. Lavez les sections avec 1x PBS 3 fois, pendant 10 min chacune. Incuber les sections avec un anticorps secondaire biotinylé suivi d’une incubation avec le complexe streptavidine-HRP à température ambiante.
   7. Incuber les sections avec une solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) pour développer une couleur brun clair ou brun foncé et visualiser les cellules immunoréactives.
   8. Contre-colorez les sections avec de l’hématoxyline et de l’ammoniac dilué à 0,3 % (v/v). Prenez des images en fond clair à un grossissement de 10X au microscope.
   9. Utilisez un programme de traitement d’images pour identifier et quantifier la population des cellules immunitaires marquées à la fois dans l’épithélium et la lamina propria (sous l’épithélium) en réglant 2 masques : utilisez le premier masque de la fonction basée sur le cube de couleur pour définir un seuil de détection des couleurs et mesurer les zones colorées réactives au DAB ; utilisez le deuxième masque pour déterminer les surfaces totales de l’épithélium et de la lamina propria dans la section examinée. Exprimer la population de cellules immunoréactives en proportion de la surface de coloration des cellules infiltrées par rapport à la surface totale du tissu examiné.