Destruction des cellules K562 par les cellules mononucléées du sang périphérique exposées à des préparations de produits du tabac

Résumé

Source : Arimilli, S. et al., Méthodes d’évaluation de la cytotoxicité et de l’immunosuppression des préparations de produits du tabac combustibles. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous étudions l’effet d’un milieu entier conditionné par la fumée, une préparation de produit du tabac combustible, sur la destruction des cellules K562 par les cellules mononucléées du sang périphérique effecteur.

Protocole

1. K562 Essai de mise à mort

REMARQUE : Les cellules K562 doivent être cultivées à 37 °C et à 5 % de CO₂ avec un milieu complet RPMI jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence avant le test.

1. Préparez une solution mère de 5 mM d’ester de carboxyfluorescéine succinimidylique (CFSE) en ajoutant 18 μl de DMSO dans le flacon.
2. Diluer le WS-CM ou la nicotine dans une plaque à 96 puits à l’aide du milieu complet RPMI jusqu’à un volume total de 100 μl/puits pour obtenir les unités d’équinicotine ou les concentrations de nicotine souhaitées pour chaque puits.
   prudence: La nicotine est extrêmement toxique et dangereuse pour l’environnement.
3. Ajouter 100 μl de PBMC dans le milieu complet RPMI à une concentration de 1,5 x 10⁶ cellules/puits. Le volume total des cellules avec WS-CM ou nicotine sera de 200 μl/puits.
4. Couvrir la plaque et laisser incuber pendant 3 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
5. Laver les cellules K562 en ajoutant 10 ml de DPBS et centrifuger à 400 x g pendant 8 min à RT.
6. Remettez les cellules en suspension avec 10 ml de DPBS et comptez les cellules K562.
7. Préparez une solution de travail CFSE en ajoutant 1 μl de solution mère CFSE à 1 ml de DPBS.
8. Ajouter 1 ml de la solution de travail CFSE à 1 ml de suspension cellulaire K562 contenant 1 - 2 x 10⁷ cellules. Vortex et incuber avec précision pendant 2 min à RT.
9. Ajouter immédiatement 200 μl de FBS. Vortex et incuber avec précision pendant 2 min à RT.
10. Ajouter 10 ml de milieu complet RPMI et centrifuger le tube à 400 x g pendant 8 min à RT.
11. Retirez le surnageant RPMI, cassez la pastille, et mettez les cellules en suspension avec 10 ml de milieu complet RPMI, et comptez les cellules K562 marquées au CFSE.
12. Laver les PBMC en centrifugeant la plaque à 300 x g pendant 3 min à RT. Aspirer le surnageant en décantant le liquide. Replacez le couvercle et faites tourbillonner le bas de la plaque. Ajoutez 200 μl de milieu complet RPMI et répétez l’étape de lavage une fois de plus.
13. Ajouter des cellules K562 marquées CFSE dans un rapport de 1:15 (100 000 K562S :1,5 x 10⁶ PBMC) à chaque puits d’échantillonnage de la plaque PBMC et incuber davantage pendant 5 heures à 37 °C et 5 % de CO₂.
14. Laver le mélange cellulaire en le centrifugant à 300 x g pendant 3 min à RT. Aspirer le surnageant en jetant le liquide. Placez le couvercle et tourbillonnez le fond de l’assiette.
15. Ajoutez 200 μl de tampon de fonctionnement et répétez l’étape de lavage décrite à l’étape 14 une fois de plus.
16. Ajouter 95 μl de tampon courant suivi de 5 μl de 7AAD dans chaque puits pour un volume total de 100 μl/puits. Incuber la plaque dans l’obscurité à RT pendant 15 min.
17. Ajoutez 100 μl de tampon coulant dans chaque puits et transférez tout le volume de suspension cellulaire de chaque puits de la plaque dans les tubes en grappe et acquérez les échantillons sur le cytomètre en flux.
18. Déterminez le pourcentage de cellules 7AAD positives et CFSE positives à l’aide d’un logiciel d’analyse par cytométrie en flux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 X 75 tubes	BD Faucon	352058
Tubes coniques de 15 ml	Corning	Référence 430790
Microtubes de 2 ml	Axygen	MCT-150-C-S
Tubes coniques de 50 ml	Corning	430828
Flacon de 500 ml	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
Plaque à fond plat à 96 puits	Termo Nunc	439454
Plaques inférieures rondes à 96 puits	BD Faucon	353077
Hotte de culture cellulaire	Thermo Scientific	Série 1300 A2
centrifugeuse	Eppendorf	Référence 58110R
Le	Sondes moléculaires Life Technologies	Réf. C34554
Tubes en grappe	Corning	4401	Nocif en cas d’ingestion, cancérigène
DMSO (Diméthylsulfoxyde)	Sigma-Aldrich	D8418
Le	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	Réf. F2442
Unité de filtration	Nalgene	Référence 156-4020
Cytomètre en flux	BD Biosciences	FACS Canto II	8 couleurs à Ex 405 nm et Em785 nm.
Cytomètre en flux	BD Biosciences	FACS Calibur	4 couleurs à Ex 495 nm et Em 785 nm.
Logiciel d’analyse de cytométrie en flux	Étoile d’arbre	FlowJo
nicotine	Sigma-Aldrich	N° N3876	Toxicité aiguë, Danger pour l’environnement
Parafilm	Bemis	« M »
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	Réf. P6148	Inflammable, Irritation cutanée
Enclos/streptocoque	Gibco Life Technologies	Référence 15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologies	Référence 11875-093
Tampon en cours d’exécution	Tampon de fonctionnement MACS, Miltenyi Biotech	Tél. : 130-091-221
Pipette de transfert	Fisher Scientific	Tél. : 13-711-20
Base Tris	Sigma-Aldrich	Réf. T1503