1. Préparer un milieu synthétique pour la mucoviscidose (SCFM2)
REMARQUE : La préparation de SCFM2 comprend trois étapes principales décrites ci-dessous (Figure 1).
- Stérilisation de la mucine porcine
- Préparez de la mucine stérile à une concentration finale de 5 mg/mL dans SCFM2. Par exemple, pour un volume de 5 mL de SCFM2, pesez 25 mg de mucine de type II dans une boîte de Pétri stérile et placez-la dans un stérilisateur à ultraviolets (UV) pendant 4 h, en agitant doucement toutes les heures.
- Après 4 h, transférez la mucine traitée aux UV dans des tubes autoclavés de 1,7 mL dans des conditions stériles et conservez-la à -20 °C.
- Pour confirmer la stérilisation complète, dissolvez un échantillon de mucine dans un liquide stérile, tel que de l’eau ou du bouillon Luria-Bertani (LB), et observez au microscope.
note: La mucine stérilisée peut être conservée à -20 °C jusqu’à 6 mois.
- Préparation de la base tamponnée
- Préparez des solutions mères de sel et d’acides aminés en ajoutant les quantités appropriées en poids à l’eau désionisée, comme indiqué dans le tableau 1. Stérilisez toutes les solutions mères à l’aide d’un filtre de 0,22 μm, enveloppez-les dans du papier d’aluminium pour les protéger de la dégradation par la lumière et conservez-les à 4 °C pendant un mois maximum.
- Préparez la base tamponnée en combinant 190 mL d’eau désionisée avec des solutions mères d’acides aminés et de sels par volumes indiqués au tableau 1. Ajustez la solution à un pH de 6,8 et augmentez jusqu’à un volume final de 250 ml. Stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 30 jours.
- La veille de l’expérience, aliquoter la quantité désirée de base tamponnée dans une fiole de culture en verre et ajouter de la mucine (5 mg/mL comme décrit à l’étape 1.1.1) et de l’ADN purifié de spermatozoïde de saumon (0,6 mg/mL). Agitez doucement, enveloppez-le dans du papier d’aluminium et laissez à 4 °C toute la nuit pour permettre à la mucine et à l’ADN de se dissoudre dans la solution.
note: Les aliquotes d’ADN de spermatozoïdes de saumon doivent être décongelées sur de la glace, pulvérisées au vortex et ajoutées à une base tamponnée et à de la mucine. Les solutions mères de tryptophane, d’asparagine et de tyrosine doivent être préparées dans des solutions de NaOH (voir le tableau 1 pour les concentrations) au lieu d’eau désionisée. Conservez la base tamponnée et toutes les solutions mères enveloppées dans du papier d’aluminium pour les protéger de l’exposition à la lumière. La plupart des actions resteront stables jusqu’à un mois. Les crosses qui se décolorent ne doivent pas être utilisées et doivent être remplacées avant utilisation.
- Ajout d’actions supplémentaires
- Le jour de l’expérience, ajouter les stocks énumérés au tableau 2 à la base tamponnée contenant de la mucine et de l’ADN
note: Préparez une solution fraîche de FeSO4 le jour de l’expérience, mais tous les autres stocks peuvent être préparés à l’avance et conservés pendant 30 jours à 4 °C. La 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) contient du chloroforme. Manipulez avec précaution et ne l’utilisez pas à proximité de flammes nues. Après l’ajout de DOPC, incuber SCFM2 à 37 °C en agitant (250 tr/min) pendant au moins 20 min (pour une culture de 5 mL). Cette période d’incubation permet au chloroforme dans le DOPC de s’évaporer. La fiole ne doit pas être hermétique ; Au lieu de cela, couvrez l’ouverture de la fiole sans serrer avec du papier d’aluminium.
2. Évaluation en temps réel de la tolérance aux antimicrobiens dans les agrégats bactériens
- Préparer les cultures de nuit
- La veille de l’expérience, inoculer 5 mL de bouillon LB avec plusieurs colonies de Pa PAO1-pMRP9-113 à partir d’une plaque de gélose LB contenant un antibiotique (carbénicilline 300 μg/mL). Cultiver pendant la nuit à 37 °C avec agitation à 250 tr/min.
note: Cultivez des cultures de nuit avec l’ajout d’antibiotiques nécessaires à la sélection des plasmides requis (ici, le plasmide d’expression de la protéine fluorescente verte (GFP), pMRP9-1). Veuillez noter que les cellules Pa doivent être lavées avant l’inoculation de SCFM2. LB peut être substitué à d’autres milieux de laboratoire riches pour les cultures de nuit. Tous les isolats bactériens doivent être manipulés conformément aux directives BSL-2 appropriées tout au long du présent protocole.
- Inoculer SCFM2
- Le jour de l’expérience, diluer à contre-courant des cultures de nuit de Pa 1:10 (culture : milieu liquide) en inoculant 500 μL dans 5 mL de bouillon LB frais. Cultiver les cellules jusqu’à la phase logarithmique (60-90 min) à 37 °C avec agitation à 250 tr/min.
- Centrifuger les cultures en phase logarithmique à 10 000 × g pendant 5 min. Laver les cellules en retirant le surnageant et en les remettant en suspension dans 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate stérilisée par filtre (PBS, pH 7,0). Répétez l’opération deux fois et remettez la pastille en suspension dans un volume final de 1 mL de PBS.
- Mesurer l’absorbance des cellules lavées à l’aide d’un spectrophotomètre à 600 nm (OD600), et calculer le volume de culture requis pour une DO 600 de départ de 0,05 dans 5 mL de SCFM2. Injectez Pa dans le SCFM2 et vortex doucement pour répartir les cellules partout. Pipeter 1 mL du SCFM2 inoculé dans chaque chambre d’une boîte optique à fond de verre à 4 puits et incuber pendant 4 h de manière statique à 37 °C.
note: Le temps de doublement des cultures de Pa dépend de la souche et de la disponibilité de l’oxygène. Dans SCFM2, dans les conditions décrites ici, le temps de doublement de Pa est de ~1,4 h.
3. Visualisation des agrégats pendant le traitement antibiotique avec la microscopie confocale à balayage laser (CLSM)
REMARQUE : Cette section décrit l’utilisation d’un microscope confocal à balayage laser et d’un logiciel de capture d’images pour l’imagerie des agrégats Pa dans SCFM2. L’objectif est d’observer et de caractériser la biomasse bactérienne restante (tolérante) après un traitement aux antibiotiques. Les étapes décrites peuvent être exécutées avec succès sur d’autres microscopes confocaux, bien que le manuel d’utilisation de l’instrument doive être consulté pour des conseils spécifiques.
- Imagez les cultures de Pa à l’aide d’une chambre chauffée ou d’une microplaque chauffée installée sur la platine du microscope pour maintenir une température ambiante de 37 °C. Démarrez le module d’incubation au moins 2 h avant le début de l’expérience pour permettre à tous les appareils d’atteindre la température souhaitée et réduire l’expansion et le mouvement pendant la collecte des données.
- Après 4 h, transférez les cultures SCFM2 contenant des cellules Pa dans la platine du microscope chauffé. Désigner 3 puits sur 4 comme réplicats techniques pour le traitement antibiotique, et considérer le 4ème puits comme un contrôle sans traitement, ne contenant que des cellules Pa dans SCFM2, sans antibiotiques. Identifiez les agrégats à l’aide de la microscopie à fond clair dans l’onglet Localiser avant toute excitation des rapporteurs fluorescents. Définissez une zone d’imagerie à l’intérieur de chaque puits et enregistrez sa position (coordonnées x-y-z) à l’aide du module Positions du logiciel d’imagerie.
- À l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 63x, visualisez les cultures de Pa contenant le plasmide d’expression GFP pMRP9-1 dans SCFM2 avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 509 nm. Prenez des images à l’aide de l’option z-stack du module d’acquisition à des intervalles de 1 μm (total de 60 coupes). Utilisez le module de calcul de la moyenne de ligne pour réduire la fluorescence de fond dans le canal GFP dans le volume total des images de la pile z de 60 μm (1 093,5 mm3). Prenez des images de contrôle de SCFM2 non inoculé en utilisant des paramètres identiques pour déterminer la fluorescence de fond pour l’analyse d’image.
note: Les images sont acquises en produisant des images de pile Z 8 bits de 512 pixels x 512 pixels (0,26 μm x 0,26 μm pixels) situées à 60 μm de la base de la lamelle.
- Utilisez l’option de série chronologique du logiciel d’imagerie pour capturer 60 coupes à chaque position (puits) à des intervalles de 15 minutes sur une période de 18 h. Utilisez la stratégie de mise au point définie dans le logiciel pour stocker un plan focal pour chaque position, qui est renvoyé à chaque point temporel tout au long de l’expérience.
- Après un total de 4,5 h d’incubation, imagez chaque position à l’aide des paramètres ci-dessus pour déterminer la biomasse globale dans chacun des quatre puits avant l’ajout de l’antibiotique.
- Après 6 h d’incubation totale, ajouter l’antibiotique à une concentration inhibitrice (CMI) inférieure à 2x dans chaque réplication. Pipetez directement et doucement au milieu du puits, juste en dessous de l’interphase air-liquide. Conservez toutes les cultures dans la chambre confocale chauffée.
note: Ici, du sulfate de colistine à une concentration de 140 μg/mL a été utilisé.
- Commencez l’imagerie post-traitement antibiotique en cliquant sur l’option Démarrer l’expérience dans le programme d’imagerie.
note: La concentration d’antibiotique utilisée dépend de l’antibiotique, de l’isolat de Pa et de la volonté de l’utilisateur d’examiner les effets de destruction ou de tolérance. Cette expérience utilise une dose unique. Des doses supplémentaires peuvent être ajoutées sans perturber les cultures si nécessaire.
4. Coloration à l’iodure de propidium des agrégats de Pa
REMARQUE : L’iodure de propidium (PI) est couramment utilisé comme réactif de coloration pour identifier les cellules bactériennes non viables (mortes) en culture. Il permet ici d’identifier les agrégats sensibles au traitement antibiotique appliqué en section 3. Tout au long de ce protocole, l’expression et la détection de la GFP dans les cellules Pa sont utilisées comme principal indicateur de la viabilité cellulaire. Cette dernière étape permet d’utiliser à nouveau l’imagerie confocale pour identifier le positionnement spatial des agrégats vivants/morts les uns par rapport aux autres. De plus, les agrégats sont identifiés comme vivants/morts pour un tri cellulaire plus poussé en aval dans la section 3.
- Après 18 h, ajoutez de l’IP dans chaque puits de la boîte inférieure optique à quatre chambres contenant les cultures SCFM2. Suivez les instructions du fabricant concernant le volume d'IP et le temps d'incubation (p. ex., ~2 μL par mL de culture, ~20-30 min).
5. Isoler des cellules vivantes à partir d’agrégats à l’aide d’une approche de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
REMARQUE : FACS présente une plate-forme puissante pour trier et isoler des groupes de cellules en fonction d’un phénotype marqué par fluorescence. Ici, le FACS est utilisé pour isoler les agrégats vivants (tolérants aux antibiotiques) des agrégats non viables.
- Après la coloration à l’iodure de propidium, retirer les cultures de l’incubation et les transférer dans un instrument FACS dans un récipient isolé pour maintenir 37 °C.
- Traiter 1 mL d’aliquotes de SCFM2 contenant des agrégats de Pa au débit le plus bas.
note: Chaque aliquote contiendra ~15 000 agrégats.
- Pour détecter la GFP, illuminez les cellules avec un laser de 488 nm et enregistrez la hauteur du signal fluorescent à 530/30 nm. Visualisez la coloration PI par excitation avec un laser de 561 nm, et enregistrez la hauteur du signal fluorescent à 610/20 nm. Effectuer le tri à l’aide d’une buse 70-u.
note: Les agrégats triés peuvent être regroupés de plusieurs façons en fonction de l'application de l'utilisateur. Dans ce cas, FACS a été utilisé pour trier les agrégats de Pa viables pour le séquençage de l’ARN en aval.
Tableau 1 : Préparation des stocks de sel, d’acides aminés, d’ADN et de mucine nécessaires pour la base tamponnée d’un milieu d’expectoration synthétique de mucoviscidose, SCFM2.
| chimique | Concentration du stock (M) | Concentration finale (mM) | Notes |
| NaH2PO4 | 0,2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0,2 | 1,25 | |
| KNO3 | 1 | 0,35 | |
| K2TB4 | 0,25 | 0,27 | |
| NH4Cl | | 2,28 | Ajouter le solide directement à la base tamponnée |
| Kcl | | 14,94 | Ajouter le solide directement à la base tamponnée |
| NaCl | | 51,85 | Ajouter le solide directement à la base tamponnée |
| Vadrouilles | | 10 | Ajouter le solide directement à la base tamponnée |
| Ser | 0,1 | 1,45 | |
| Glu HCl | 0,1 | 1,55 | |
| pro | 0,1 | 1,66 | |
| Gly | 0,1 | 1.2 | |
| Ala | 0,1 | 1,78 | |
| Val | 0,1 | 1.12 | |
| rencontrèrent | 0,1 | 0,63 | |
| Ile | 0,1 | 1.12 | |
| leu | 0,1 | 1,61 | |
| Orn HCl | 0,1 | 0,68 | |
| Lys HCl | 0,1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0,1 | 0,31 | |
| Trp | 0,1 | 0,01 | Préparé en 0,2 M NaOH |
| aspic | 0,1 | 0,83 | Préparé en NaOH 0,5 M |
| Tyr | 0,1 | 0,8 | Préparé en NaOH de 1,0 m |
| Thr | 0,1 | 1,07 | |
| Cys HCl | 0,1 | 0,16 | |
| Phe | 0,1 | 0,53 | |
| Son HCl H2O | 0,1 | 0,52 | |
| ADN de spermatozoïde de saumon | | 0,6 mg/mL | |
| Mucine porcine | | 5 mg/nL | |
Tableau 2 : Préparation des stocks supplémentaires requis pour la base tamponnée du milieu d’expectoration synthétique de la mucoviscidose, SCFM2.
| chimique | Concentration du stock (M) | Concentration finale (mM) | Notes |
| Dextrose (D-glu2cose) | 1 | 3 | |
| Acide L-lactique | 1 | 9.3 | Ajuster au pH 7,0 avec NaOH |
| CaCl2*H2O | 1 | 1,75 | |
| MgCl2 * 6H2O | 1 | 0,61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/mL | 0,0036 | Préparer des produits frais tous les jours |
| N-acétylglucosamine | 0,25 | 0,3 | |
| 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocoline (DOPC) | 25 mg/mL | 100 μg/mL | Incuber pendant au moins 20 min à 37 °C après l’ajout |
