Quantification de l’infection bactérienne dans les cellules hôtes par le dosage des unités formant colonies

Résumé

Source : Gayle, P. et al., Utilisation d’un pathogène bactérien pour sonder les réponses de l’hôte au niveau cellulaire et de l’organisme.J. Vis. Exp.(2019).

Cette vidéo présente une technique de quantification in vitro pour déterminer l’infection des macrophages par Listeria monocytogenes par le test d’unité formant colonie. Les colonies bactériennes sur la plaque de gélose représentent la population bactérienne intracellulaire qui échappe au mécanisme de défense de l’hôte et survit dans les macrophages.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des cellules pour l’infection

1. Propager la lignée cellulaire de souris de type macrophage RAW 264.7 dans un milieu de culture tissulaire DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (ci-après dénommé DMEM/FCS) à l’aide d’un flacon de 125 mL et d’un incubateur de culture tissulaire maintenu à 37 °C/5 % de CO₂.
2. La veille de l’infection, à l’aide d’un grattoir à cellules, retirer les cellules de la fiole d’expansion et les recueillir dans un tube conique à bouchon à vis de 15 ml. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 10 min, décanter le surnageant, suspendre la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM/FCS (sans antibiotiques) et déterminer le titre à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
3. Ajuster le titre à 2 x 10⁶ cellules/mL et ajouter 0,10 mL (2 x 10⁵ cellules) dans les puits d’une boîte de culture tissulaire à 48 puits. Assurez-vous que la suspension cellulaire couvre toute la surface du puits.
   1. Plaquez les cellules dans des puits supplémentaires pour une source ultérieure de milieux conditionnés. Placez également 0,10 mL de DMEM/FCS dans trois puits supplémentaires pour servir de « contrôle sans cellule ».
4. Incuber toute la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C/5 % de CO₂. Le lendemain, ne pas retirer de l’incubateur tant que l’inoculum de la bactérie n’est pas préparé et prêt à l’emploi.

2. Préparation de Listeria monocytogenes (Lm) pour l’infection

1. Inoculer 2 mL de perfusion cerveau-cœur (BHI) avec une seule colonie à partir d’une plaque de gélose fraîchement striée (<2 jours) de Lm et incuber pendant la nuit à 37 °C en agitant à 130 rotations/min.
2. Le lendemain, ajouter 0,10 mL de culture de nuit à 2 mL de BHI préchauffé et poursuivre l’incubation à 37 °C en agitant jusqu’à ce que la densité optique (DO₆₀₀) soit comprise entre 0,4 et 0,6.
3. Déterminer le titre bactérien approximatif à l’aide d’une formule de conversion dérivée empiriquement. Dans notre laboratoire, une culture de Lm en croissance exponentielle dans BHI est d’environ 1,3 x 10⁹ unités formant colonies (UFC)/OD₆₀₀. Réduisez au minimum le temps d’exposition des cultures bactériennes à la température ambiante.
4. Juste avant l’infection, ajustez le titre à 5 x 10⁷ UFC/ml en utilisant du DMEM/FCS préchauffé comme diluant.

3. Infection

1. En travaillant rapidement et avec précision, ajoutez 20 μL (1 x 10⁶ UFC ; multiplicité de l’infection, MOI = 5) de l’inoculum Lm fraîchement préparé (étape 2.4 ci-dessus) dans les puits en inclinant légèrement le plat et en plaçant soigneusement l’extrémité de la pipette dans le milieu sus-jacent ;
   REMARQUE : Évitez de toucher les parois du puits avec la pointe de la pipette.
2. Pipetez doucement le contenu de chaque puits pour assurer un mélange complet ; ne secouez pas ou n’inclinez pas considérablement la plaque car cela répandrait Lm sur les parois du puits. Remettez la boîte de culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C/5 % de CO₂.
3. Préparer une solution de gentamicine de 10 μg/mL en utilisant un milieu conditionné provenant de puits non infectés comme diluant.
4. 30 minutes après l’infection (mpi), ajouter délicatement 30 μL de la solution de gentamicine (concentration finale 2,5 μg/mL) et pipeter doucement le contenu du puits comme avant et remettre la boîte de culture cellulaire dans l’incubateur à 37 °C/5 % CO₂.
5. À 60 mp/pi, prélever les puits appropriés pour l’analyse UFC (point temporel de 60 ppi) ou l’analyse MCDA (comme décrit ci-dessous aux sections 4 et 5, respectivement).
6. Pour les puits restants, à divers moments par la suite, soit récolter les cellules comme auparavant, soit, pour l’essai d’émergence Lm, retirer entièrement le milieu du puits et le remplacer par 150 μL de milieu conditionné sans gentamicine.

4. Traitement de l’échantillonnage et analyse de Lm intracellulaire et émergent par dosage CFU

1. Pour récolter, inclinez légèrement le plat et retirez soigneusement tout le média du puits. Ajouter 0,50 mL d’eau distillée stérile (dsH₂O) dans le puits. Après 30 s, transférez le lysat d’eau obtenu (10⁰) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et agitez vigoureusement pendant 10 s.
2. Préparez des dilutions ^10-1 et ^10-2 en ajoutant 4,5 μL ou 50 μL de lysat d’eau à 450 μL de dsH₂O et un bref tourbillon pour assurer un mélange complet.
3. Étaler 50 μL des 10 échantillons⁰, ^10-1 et/ou ^10-2 sur des plaques de gélose à base de bouillon de lysogénie (LB).
4. Pour détecter la présence de Lm émergent (étape 3.6 ci-dessus), prélever 10 μL du milieu de recouvrement et le diviser en deux aliquotes de 5 μL : à une aliquote, ajouter 5 μL de DMEM/FCS et à la deuxième aliquote, ajouter 5 μL de DMEM/FCS contenant 5 μg/mL de gentamicine. Ce dernier contrôle fait la distinction entre le Lm extracellulaire (sensible à la gentamicine) et le Lm intracellulaire (résistant à la gentamicine) dans le test CFU ultérieur.
5. Après 5 min à température ambiante, ajouter 90 μL de dsH₂O, agiter vigoureusement pendant 10 s et étaler 50 μL sur des plaques de gélose LB.
6. Énumérer les colonies de Lm sur des plaques de gélose LB après 2 jours d’incubation à 37 °C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouillon BHI (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
Supports DMEM	Gibco	Référence 11965-092
FBS - Inactivé par la chaleur	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Gélose LB	Cellules en croissance MS	Référence MBPE-4040
Plaques de culture tissulaire TPP à 48 puits	MIDSCI	TP92048