Analyse par cytométrie en flux de Listeria monocytogenes intracellulaire et extracellulaire émergent in vitro

Résumé

Source : Gayle, P. et al., Utilisation d’un pathogène bactérien pour sonder les réponses de l’hôte au niveau cellulaire et de l’organisme. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous quantifions Listeria monocytogenes intracellulaire et extracellulaire, une bactérie pathogène intracellulaire, suite à l’infection de macrophages cultivés in vitro à l’aide de la cytométrie en flux.

Protocole

1. Traitement de l’échantillonnage et analyse de Lm intracellulaire et émergente par cytométrie en flux (FCM)

1. Préparer une lignée cellulaire de type macrophage de souris RAW 264.7 dans un milieu de culture tissulaire DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (ci-après appelé DMEM/FCS) à l’aide d’une fiole de 125 mL et d’un incubateur de culture tissulaire maintenu à 37 °C/5 % de CO₂. Ajustez les cellules à 1 x 10⁶ cellules/mL et ajoutez 1 mL (1 x 10⁶ cellules) dans les puits d’une boîte de culture tissulaire à 6 puits.
2. Préparer l’inoculum de Listeria monocytogenes, Lm, bacterium et infecter les cellules avec le volume d’inoculum correspondant à un MOI de 50 (5 x 10⁷ UFC).
3. 1,5 heure après l’infection (hpi), prélever le milieu dans le premier ensemble de puits et le placer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et le placer sur de la glace jusqu’à ce que tous les puits aient été traités.
4. Pour recueillir le Lm intracellulaire, ajoutez 1 mL de ds H₂O dans le puits et, après 60 s, transférez le lysat d’eau obtenu dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 500 μL de PFA à 4 %. Agitez vigoureusement pendant 10 secondes et placez sur de la glace jusqu’à ce que tous les puits aient été traités.
5. Pour les puits restants, retirer le milieu et le remplacer par 1 mL de DMEM/FCS par 5 μg/mL de gentamicine pour tuer le Lm extracellulaire et retourner rapidement les cellules dans l’incubateur.
6. Après 30 minutes (2 hpi), retirez le support et remplacez-le par du DMEM/FCS sans gentamicine.
7. Après 2 et 4 h (4 et 6 hpi), prenez les deuxième et troisième points de temps en collectant des milieux et des lysats.
8. Tubes à centrifuger à 10 000 x g pendant 7 min. Éliminer le surnageant sans perturber la pastille.
9. Suspendre chaque pastille dans un cocktail de coloration de 50 μL de PFA à 4 % et de 15 μL de phalloïdine. Incuber les tubes dans l’obscurité à 4 °C pendant 20 min.
10. Après l’incubation, ajoutez 1 ml de tampon FACS dans chaque tube et pipetez de haut en bas pour mélanger.
11. Essorer les tubes à 10 000 x g pendant 7 min. Retirer le surnageant sans déranger la pastille.
12. Suspendre chaque pastille dans 400 μL de tampon FACS pour une utilisation immédiate, ou 200 μL de tampon FACS et 200 μL de PFA à 4 % si elle est stockée pour une analyse ultérieure.
13. Analysez les échantillons par cytométrie en flux et analysez les données recueillies.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bouillon BHI (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
Crépine de cellule, 70 μm	VWR	Référence 10199-656
Collagénase D	Roche	11088858001
Supports DMEM	Gibco	Référence 11965-092
Tubes FACS	BD Faucon	352054
FBS - Inactivé par la chaleur	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
La solution de sel équilibré de Hanks	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
Gélose LB	Cellules en croissance MS	Référence MBPE-4040
LIVE/DEAD Kit de teinture jaune à cellules mortes fixable	Technologies de la vie	L349S9
Rhodamine Phalloïdine	Thermo Fischer	R415
Analyseur spectral SP6800	Sony
Plaques de culture tissulaire TPP à 48 puits	MIDSCI	TP92048
Plaques de culture tissulaire TPP à 6 puits	MIDSCI	TP92406