1. Collecter et préparer les mouches
- Arrière Drosophila melanogaster dans les conditions expérimentales souhaitées. Veillez à ne pas surpeupler les mouches pendant l’élevage et assurez-vous que les densités larvaires sont cohérentes d’un traitement à l’autre, car les conditions environnementales pendant le stade larvaire peuvent profondément affecter les phénotypes de défense immunitaire pendant le stade adulte.
- Prélever les mouches expérimentales 0 à 3 jours après l’éclosion de la nymphe et les transférer sur un milieu frais.
- Hébergez les mouches collectées à la température souhaitée (des températures comprises entre 22 °C et 28 °C conviennent généralement) jusqu’à ce qu’elles soient âgées de 5 à 7 jours après l’éclosion.
note: Cela laisse suffisamment de temps aux mouches pour terminer leur métamorphose et devenir des adultes matures, mais bien avant le début de la sénescence.
- Triez le nombre souhaité de mouches dans un flacon séparé avant l’infection, en prenant soin d’éviter l’encombrement.
note: Seuls les mâles sont infectés dans cette démonstration, mais il est tout aussi possible d’infecter les femelles en utilisant la procédure décrite.
2. Cultiver et préparer des bactéries
- Préparez une plaque maîtresse de la bactérie choisie au moins 2 jours avant l’infection. Striez les bactéries d’un stock de glycérol à 15 % stocké indéfiniment à -80 °C. Conservez la plaque maîtresse à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Striez toujours les plaques maîtresses directement à partir du stock de glycérol congelé. Évitez le passage en série de bactéries d’une plaque à l’autre, car un passage répété en culture peut provoquer une virulence atténuée des bactéries.
note: Cet exemple utilise Providencia rettgeri et Escherichia coli.
- Utilisez la procédure suivante pour préparer une suspension bactérienne pour injection.
- Cultivez une culture de 2 ml de bactéries en inoculant un milieu stérile avec une seule colonie isolée de la plaque maîtresse. Développer la bactérie jusqu’à la phase stationnaire (par exemple, croissance O/N à 37 °C).
note: P. rettgeri et E. coli se développent bien dans le bouillon Luria à des températures de 20 à 37 °C avec une légère agitation.
- Une fois que la culture a atteint la phase stationnaire, granulez doucement les cellules d’environ 600 μl de la culture dans une centrifugeuse de table (3 min à 5 000 x g), jetez le surnageant et remettez les bactéries en suspension dans environ 1 000 μl de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS ; 137 mM de chlorure de sodium, NaCl, 2,7 mM de chlorure de potassium, KCl, 10 mM phosphate de sodium, Na2PO4, 1,8 mM de dihydrogénophosphate de potassium, KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluer les cellules remises en suspension dans du PBS stérile pour obtenir une densité optique (DO) appropriée à la bactérie utilisée, mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre comme l’absorbance à 600 nm. Utilisez cette suspension pour infecter les mouches.
note: A600 = 0,1 ou 1,0 correspond respectivement à environ 10,8 et 10,9 Providencia rettgeri ou E. coli par ml. Étant donné que les bactéries vivantes et mortes contribuent à la densité optique, il est important de récolter les cultures tôt dans la phase stationnaire avant que les cadavres bactériens ne s’accumulent et ne faussent la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries viables introduites lors de l’infection.
3. Infecter les mouches
REMARQUE : Comme l’immunité de la drosophile est influencée par le rythme circadien, il est important de réaliser des infections à un moment similaire de la journée sur les répliques expérimentales.
- Utilisation d’un nano-injecteur
- Préparez les aiguilles de verre pour l’infection.
- Préparez une aiguille en verre en tirant un capillaire en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur de micropipette.
- À l’aide d’une pince, casser la pointe de l’aiguille pour créer une ouverture d’environ 50 m de diamètre pour permettre l’éjection du liquide.
- Assemblez l’injecteur.
- Placez le joint torique d’étanchéité, puis l’entretoise blanche (grande fossette vers l’extérieur) sur le piston métallique.
- Remplissez l’aiguille de verre d’huile minérale à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 30 G.
- Insérez l’aiguille de verre remplie dans la pince, puis placez le plus grand joint torique autour de sa base, à environ 1 mm de l’extrémité émoussée de l’aiguille.
- Faites glisser l’aiguille sur le piston métallique et vissez doucement la pince jusqu’à ce qu’elle soit bien fixée.
- Éjectez la majeure partie de l’huile minérale de l’injecteur, mais assurez-vous qu’il y a encore un petit volume d’huile dans l’aiguille pour agir comme une barrière entre l’injecteur et la suspension bactérienne. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans l’huile minérale ou la suspension bactérienne, ou entre les deux liquides.
- Réglez l’injecteur sur le volume souhaité pour l’injection (entre 9 nl et 50 nl).
- Générer des contrôles de blessure.
- Remplissez l’aiguille de l’injecteur avec du PBS stérile en insérant soigneusement l’extrémité de l’aiguille capillaire dans un tube du média et en appuyant sur le bouton « fill » de l’injecteur.
note: Des milieux de croissance bactérienne stériles peuvent également être utilisés comme contrôle des plaies si l’expérience nécessite l’injection de bactéries en suspension dans leur milieu de croissance. Cependant, étant donné que les milieux de croissance bactérienne contiennent des composants qui peuvent stimuler le système immunitaire ou avoir d’autres effets sur l’hôte, un support inerte tel que le PBS est préférable.
- Anesthésier le nombre souhaité de mouches sous un léger flux de dioxyde de carbone (CO2).
- Injectez les mouches dans la partie antérieure de l’abdomen sur la surface ventrolatérale avec le PBS stérile.
note: Il est également possible d’injecter des mouches à d’autres endroits, comme la plaque sternopleurale du thorax, mais il est important de garder le site d’injection cohérent dans chaque expérience.
- Placez les mouches injectées dans des flacons frais avec un nouveau milieu, en posant les flacons sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient remises de l’anesthésie pour éviter que les mouches ne se collent à la nourriture.
note: Il est recommandé d’injecter les mouches témoins PBS avant d’injecter des bactéries dans des mouches expérimentales afin que la même aiguille puisse être utilisée pour les deux traitements. Il ne sera pas toujours possible d’utiliser la même aiguille pour toute une expérience. Dans ce cas, il peut être souhaitable d’enregistrer quelle aiguille a été utilisée avec quelle mouche et d’inclure l’identité de l’aiguille comme facteur expérimental dans l’analyse statistique.
- Injectez l’agent pathogène bactérien.
- Éjectez le milieu stérile restant de l’injecteur et remplissez la même aiguille avec la suspension bactérienne.
- Répéter la procédure ci-dessus (3.1.3), en injectant maintenant aux mouches la suspension bactérienne préparée dans la procédure 2.2.
