1. Collecter et préparer les mouches
- Arrière D. melanogaster dans les conditions expérimentales souhaitées. Veillez à ne pas surpeupler les mouches pendant l’élevage et assurez-vous que les densités larvaires sont cohérentes d’un traitement à l’autre, car les conditions environnementales pendant le stade larvaire peuvent profondément affecter les phénotypes de défense immunitaire pendant le stade adulte.
- Prélever les mouches expérimentales 0 à 3 jours après l’éclosion de la nymphe et les transférer sur un milieu frais.
- Hébergez les mouches collectées à la température souhaitée (des températures comprises entre 22 °C et 28 °C conviennent généralement) jusqu’à ce qu’elles soient âgées de 5 à 7 jours après l’éclosion.
note: Cela laisse suffisamment de temps aux mouches pour terminer leur métamorphose et devenir des adultes matures, mais bien avant le début de la sénescence.
- Triez le nombre souhaité de mouches dans un flacon séparé avant l’infection, en prenant soin d’éviter la surpopulation.
note: Seuls les mâles sont infectés dans cette démonstration, mais il est tout aussi possible d’infecter les femelles en utilisant la procédure décrite.
2. Cultiver et préparer des bactéries
- Préparez une plaque maîtresse de la bactérie choisie au moins 2 jours avant l’infection. Striez les bactéries d’un stock de glycérol à 15 % stocké indéfiniment à -80 °C. Conservez la plaque maîtresse à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Striez toujours les plaques maîtresses directement à partir du stock de glycérol congelé. Évitez le passage en série de bactéries d’une plaque à l’autre, car un passage répété en culture peut provoquer une virulence atténuée des bactéries.
note: Cet exemple utilise Providencia rettgeri et Escherichia coli.
- Utilisez la procédure suivante pour préparer une suspension bactérienne pour injection.
- Cultivez une culture de 2 ml de bactéries en inoculant un milieu stérile avec une seule colonie isolée de la plaque maîtresse. Développer les bactéries jusqu’à la phase stationnaire (par exemple, croissance O/N à 37 °C).
note: P. rettgeri et E. coli se développent bien dans le bouillon Luria à des températures de 20 à 37 °C avec une légère agitation.
- Une fois que la culture a atteint la phase stationnaire, granulez doucement les cellules d’environ 600 μl de la culture dans une centrifugeuse de table (3 min à 5 000 x g), jetez le surnageant et remettez les bactéries en suspension dans environ 1 000 μl de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS ; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluer les cellules remises en suspension dans du PBS stérile pour obtenir une densité optique (DO) appropriée à la bactérie utilisée, mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre comme l’absorbance à 600 nm. Utilisez cette suspension pour infecter les mouches.
note: A600 = 0,1 ou 1,0 correspond respectivement à environ 10,8 et 10,9 Providencia rettgeri ou E. coli par ml. Étant donné que les bactéries vivantes et mortes contribuent à la densité optique, il est important de récolter les cultures tôt dans la phase stationnaire avant que les cadavres bactériens ne s’accumulent et ne faussent la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries viables introduites lors de l’infection.
3. Infecter les mouches
REMARQUE : Comme l’immunité de la drosophile est influencée par le rythme circadien, il est important de réaliser des infections à un moment similaire de la journée sur les répliques expérimentales.
- Avec piqûre d’épingle septique
- Préparez l’aiguille pour la piqûre.
- Faites fondre l’extrémité d’une pointe de micropipette de 200 μl et insérez une goupille de minutien d’insecte de 0,15 mm dans le plastique fondu. Laissez le plastique se solidifier de sorte que la goupille soit maintenue en place avec environ 0,5 cm de la goupille dépassant du plastique.
- Générer des contrôles de blessure.
- Anesthésie le nombre de mouches souhaité sous un léger flux de CO2.
- Piquez les mouches dans la plaque sternopleurale du thorax avec l’aiguille, en évitant les sites d’attache des ailes et des pattes. Si nécessaire, retirez délicatement les mouches de la goupille à l’aide d’une pince souple.
note: Il est également possible de piquer les mouches à d’autres endroits, comme l’abdomen antérieur sur la surface ventrolatérale, mais il est important de garder le site d’injection cohérent dans chaque expérience. Piquer à travers la cuticule de l’abdomen a tendance à être plus difficile que de piquer le thorax et est donc moins fréquent.
- Placez les mouches piquées dans un flacon frais avec un nouveau milieu anti-mouches, en posant le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient remises de l’anesthésie pour éviter que les mouches ne se collent à la nourriture.
- Introduisez l’infection bactérienne.
- Anesthésie le nombre de mouches souhaité sous un léger flux de CO2.
- Piquez chaque mouche au même endroit que les témoins du milieu, en trempant l’extrémité de la broche dans la suspension bactérienne préparée selon la procédure 2.2 avant de piquer chaque mouche.
- Placez les mouches piquées dans un flacon frais avec un nouveau milieu anti-mouches, en posant le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient remises de l’anesthésie pour éviter que les mouches ne se collent à la nourriture.