Mesure de la charge bactérienne d’E. coli chez Drosophila melanogaster après une infection à E. coli

Résumé

Source : Khalil, S., et al. Infection bactérienne systémique et phénotypes de défense immunitaire chez Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique de mesure de la charge bactérienne d’E. coli après l’injection d’E. coli dans le thorax de Drosophila melanogaster.

Protocole

1. Dosage de la charge bactérienne après l’infection

1. Mesurez la charge bactérienne.
   1. À un moment prescrit après l’injection, placez chaque mouche dans un tube de microcentrifugation sur de la glace.
   2. Ajoutez 250 μl de PBS dans chaque tube et homogénéisez les mouches à l’aide d’un pilon ou d’un batteur à billes.
   3. Plaquez l’homogénat sur une plaque de gélose LB, soit à l’aide d’un plateau en spirale, soit d’une dilution en série.
      1. Pour plaquer en utilisant la dilution en série, transférez chaque homogénat de mouches sur la première rangée d’une plaque de 96 puits.
      2. Remplissez chaque puits des rangées restantes avec 90 μl de PBS.
      3. À l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 10 μl de la première rangée contenant l’homogénat de mouches et distribuer dans la deuxième rangée.
      4. Pipetez de haut en bas au moins 10 fois pour bien mélanger, puis prélevez 10 μl et transférez sur la troisième rangée. Répétez cette procédure en utilisant les rangées restantes.
      5. En commençant par la rangée du bas (suspension bactérienne la plus diluée), utilisez la pipette multicanaux pour prélever 10 μl de chaque puits et les déposer sur une plaque LB, en veillant à ce que les échantillons soient distribués sous forme de points discrets qui ne se touchent pas. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les puits aient été échantillonnés dans chaque rangée, en les distribuant par ordre décroissant de dilution sur la plaque LB.
      6. Laissez la plaque sur RT jusqu’à ce que les taches soient complètement imprégnées dans la plaque LB.
         note: Il est recommandé de sécher la plaque LB pendant quelques jours à RT avant de l’utiliser pour s’assurer que le liquide est facilement absorbé, minimisant ainsi les risques de contact accidentel entre les points d’échantillon.
   4. Incuber les plaques O/N, en prenant soin de ne pas les envahir afin que les colonies restent petites et discrètes.
      note: En fonction du milieu de croissance bactérienne et de la température d'incubation utilisée, des colonies dérivées du microbiote intestinal endogène de la mouche peuvent éventuellement apparaître sur la plaque. Cependant, la plupart des bactéries utilisées pour les infections pathogènes se développent beaucoup plus rapidement que le microbiote intestinal sur la gélose LB à 37 °C.
   5. Retirez les plaques de l’incubateur lorsque les bactéries expérimentales ont développé des colonies visibles (généralement 8 à 12 heures), mais avant l’apparition des colonies de microbiote intestinal de la drosophile (environ 36 heures). Pour les bactéries expérimentales à croissance lente, utilisez un antibiotique sélectif dans la gélose LB pour retirer toutes les colonies du microbiote intestinal.
   6. Comptez le nombre de colonies pour chaque homogénat.
      1. Pour les plaques spiralées, comptez les colonies qui se développent à l’aide d’un compteur de colonies automatisé qui peut estimer la charge bactérienne par ml d’homogénat en fonction du nombre et de la position des colonies sur la plaque.
         REMARQUE : Les comptages en spirale sont plus précis lorsque la concentration bactérienne est de l’ordre de 5 x 10² à 5 x 10⁴ bactéries par ml.
      2. Pour les plaques ponctuelles, comptez manuellement les colonies de chaque mouche à partir de la dilution contenant 30 à 300 colonies et calculez le nombre de bactéries par ml d’homogénat d’origine.
2. Analysez les données.
   1. Si la charge bactérienne n’est pas normale, transformez les données pour mieux approximer une distribution normale ou analysez les données à l’aide d’une analyse statistique non paramétrique (p. ex., test U de Mann-Whitney). Utilisez une analyse de Box-Cox pour trouver la transformation optimale ; Les transformations logarithmiques naturelles ou en base -10 sont souvent efficaces.
   2. Si les données sont suffisamment réparties normalement et qu’il n’y a que deux traitements opposés, effectuez un test t pour déterminer si les deux traitements entraînent des charges bactériennes moyennes différentes. S’il existe plusieurs variables expérimentales ou d’autres facteurs potentiellement prédictifs, utilisez l’analyse de variance (ANOVA) pour déterminer quels facteurs sont des prédicteurs significatifs de la charge bactérienne.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de Pétri avec couvercles transparents, arête surélevée ; 100 x 15 mm ;	VWR international	Référence 25384-302
LB Agar, Miller	Difco	Référence 244520
Boucle d’inoculation	VWR international	Référence 80094-488
Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml ; Rite du sceau	États-Unis d’Amérique Scientifiques Inc.	Référence 1615-5500
pilon motorisé ; Agitateur de laboratoire Talboys	Troemner	103
Homogénéisateur à haut débit Talboys	Diagnostics OPS	930145
5/32'' Boules de broyage	Diagnostics OPS	GBSS 156-5000-01
Génie du vortex	Industries scientifiques inc.	G560
Pipette multicanaux (10uL-300uL)	Sartorius	Référence 730360
WASP2 Whitley Plateau à spirale automatisé	Microbiologie internationale
Compteur de colonies automatisé ProtoCOL / compteur de plaques / lecteur de plaques	Microbiologie internationale
incubateur	Powers Scientific, Inc	DROS52SD