Dosage de la dose infectieuse du virus de la drosophile C dans des cellules d’insectes en culture

Résumé

Source : Yang, S. et al., Établissement de l’infection virale et analyse de l’interaction hôte-virus chez Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons le test d’effet cytopathique pour déterminer la dose virale infectieuse du virus de la drosophile C sur les cellules de la drosophile S2* de culture tissulaire. Une gamme de concentrations virales est utilisée pour infecter les cellules cultivées. La proportion de cellules présentant des changements structurels est déterminée, et ces données sont utilisées pour calculer la dose infectieuse de culture tissulaire.

Protocole

1. Mesure de la charge du virus de la drosophile C par dosage CPE

1. Choisissez 5 tubes contenant un virus au hasard pour déterminer la dose infectieuse moyenne de culture tissulaire virale (TCID₅₀) par un test d’effet cytopathique (CPE) (1 unité de TCID₅₀ = 0,7 unité formant une plaque [PFU]).
   note: L’EPC fait référence aux changements structurels dans les cellules hôtes causés par l’invasion virale. Le virus infectieux provoque la lyse de la cellule hôte ou lorsque la cellule meurt sans lyse en raison d’une incapacité à se reproduire.
2. Le jour 1, prélever les cellules S2* préparées par pipetage. Comptez le numéro de portable. Centrifugez les cellules pour 300 x g pendant 4 min et jetez le surnageant. Diluer les cellules à la densité de 1 x 10⁶ cellules/mL avec un milieu complet pour les cellules S2*.
3. Ensemencer 1 x 10⁵ cellules S2* (100 μL) par puits dans la plaque à fond plat de 96 puits (~30 % de confluence).
4. Effectuez des dilutions en série de 10 fois du stock DCV avec un milieu complet pour les cellules S2*. Ajouter 50 μL de dilutions dans le puits. Ajouter 50 μL de milieu de culture sans virus dans le puits classé comme puits témoin négatif.
   note: Pour chaque taux de dilution, 8 puits ont été utilisés. Comme le rendement typique du DCV est d’environ 10^{8-10 9} PFU/mL, la dilution doit au moins couvrir ~10^−5-10−10.
5. Le jour 4, observez l’EPC avec un microscope à fond clair avec un objectif 20X ou 40X. Classez un puits dans lequel les cellules semblent floues et le milieu est plein de fragments comme un « puits positif », et un puits dans lequel la morphologie cellulaire est normale comme un « puits négatif ».
6. Marquez les puits positifs ou négatifs CPE avec + ou -, respectivement. Calculer le TCID₅₀ du virus par la méthode de Reed et Muench.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml	marque	Référence 352070
Boîte de culture cellulaire de 10 cm	sigma	CLS430167	Culture cellulaire
Incubateur cellulaire	Sanyo	MIR-553
centrifugeuse	Eppendorf	5810R
centrifugeuse	Eppendorf	5424R
Incubateur de drosophile	Percival	I-41NL	L’élevage de la drosophile
FBS	Invitrogen	Référence 12657-029	Culture cellulaire
Milieu pour insectes de Schneider	sigma	Réf. S9895	Culture cellulaire
Logiciel statistique	GraphPad Prism 7
Assiette à fond plat à 96 puits	sigma	CLS3922	Culture cellulaire
Incubateur cellulaire	Sanyo	MIR-553
microscope	Olympe	CKX41