Détection de l’activation de l’inflammasome par microscopie à fluorescence

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Prélèvement de moelle osseuse

1. Retirez aseptiquement le fémur et le tibia d’une souris et nettoyez les os à l’aide d’instruments stériles. Placez les os nettoyés dans du milieu Dulbecco Modified Eagle (DMEM) + 5 mM d'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES) + 0,2 mg/mL de L-glutamine + 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol + 50 mg/mL de sulfate de gentamicine + 10 000 U/mL de pénicilline/streptomycine + 10 % de sérum fœtal bovin (FBS, DMEM-10 complet) et incubez le tube sur de la glace pendant 15 min.
2. Retirez les rotules proximales et distales à l’aide de ciseaux. Insérez une aiguille de 25 g attachée à une seringue de 10 ml remplie de milieu dans le creux des os. Rincer la moelle osseuse à l’aide de DMEM-10 complet. Remettez en suspension les grumeaux en pipetant doucement le milieu de haut en bas.
3. Centrifugez les cellules pendant 10 min à 300 x g et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. À ce stade, congelez les cellules à l’aide de 90 % de FBS + 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) ou plaquez les cellules dans une boîte de Pétri de 15 cm pour différencier les macrophages à l’aide d’un milieu conditionné L929 (étape 2.1).

2. Différenciation des macrophages dérivés de la moelle osseuse

1. À l’aide d’un milieu de différenciation préchauffé (21 ml de DMEM-10 complet et 9 ml de milieu conditionné à des cellules L929, tel que décrit par Swanson et al.), placez les cellules de la moelle osseuse dans une boîte de Pétri de 15 cm non traitée par culture tissulaire (1,2-1,5 x 10⁷ cellules). Incuber la plaque à 37 °C et à 5 % de dioxyde de carbone, ou CO₂ pendant 7 jours. Ajouter 30 ml supplémentaires de milieu de différenciation dans la plaque le jour 3 ou 4.
   note: Il est important de ne pas utiliser de plaques traitées pour la culture tissulaire, car les macrophages seront difficiles à détacher et à récolter.
2. Pour recueillir les macrophages, laver la plaque avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 20 mL de PBS froid + 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Incuber la plaque à 4 °C pendant 10 min. Récoltez les cellules en pipetant le PBS + EDTA sur les cellules et en lavant la plaque avec 10 mL de PBS. Combinez les deux lavages dans deux tubes coniques de 15 ml.
3. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 10 min et remettez les cellules en suspension dans 10 ml de DMEM sans rouge de phénol + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamine + 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol + 5 % FBS (DMEM-5) et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur Coulter. Gardez les cellules sur de la glace pendant le comptage.
4. Ensemencer les macrophages dans des plaques recouvertes de culture tissulaire à raison de 2 x 10⁵ cellules/mL. Pour les expériences de microscopie, ensemencer 1 mL de cellules sur des lamelles dans des plaques à 24 puits. Pour les tests de libération de lactate déshydrogénase (LDH), ensemencer 100 μL de cellules dans une plaque à 96 puits. Pour l’essai LDH, amorcer 9 puits (3 puits non traités, 3 puits avec des contrôles de lyse à 100 % et 3 puits pour le stimulus expérimental).
5. Centrifugez la plaque de 96 puits pendant 5 minutes à 300 x g pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties dans le puits.
6. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C + 5 % de CO₂ avant de commencer le processus d’amorçage.

3. Amorçage

1. Remplacer le milieu par un milieu frais (DMEM-5) contenant 100 ng/mL de lipopolysaccharide ou de LPS (500 μL pour la plaque à 24 puits ou 50 μL pour la plaque à 96 puits).
   note: Il existe une variété de variations structurelles dans le LPS, qui affectent la capacité à stimuler l’amorçage médié par TLR4. Le LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) est disponible auprès de plusieurs fournisseurs et est recommandé.
2. Incuber la plaque pendant 3 h à 37 °C et 5 % de CO₂.

4. Activation de l’inflammasome NLRP3 avec la nigéricine et marquage avec FAM-YVAD-FMK

1. Retirez le milieu et remplacez-le par 290 μL de DMEM-5 contenant 5 μM de nigéricine et 5 mM de glycine. La glycine est ajoutée pour réduire la quantité de lyse cellulaire qui se produit lors de l’activation de la caspase-1. Incuber pendant 60 min à 37 °C et 5 % CO₂. Utilisez à la fois des macrophages de type sauvage et des macrophages déficients en caspase-1 pour s’assurer que l’étiquetage observé est spécifique à la caspase-1.
2. Au cours des 45 dernières minutes, ajouter 10 μL de 30x FAM-YVAD-FMK, préparés selon les instructions du fabricant.
3. Après 60 min, retirez le milieu et lavez les cellules trois fois pendant 5 min chacune avec 1 mL de PBS froid.
4. Ajouter 250 μL de paraformaldéhyde à 2 % dans chaque puits et incuber sur de la glace recouverte de papier d’aluminium pendant 30 min.
5. Au cours des 5 dernières minutes, ajoutez 4 μL de colorant d'acide nucléique fluorescent rouge lointain de 0,2 mM pour marquer les noyaux. Le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou d'autres colorants peuvent également être utilisés pour marquer l'ADN.
6. Lavez les cellules trois fois avec 1 mL de PBS froid et fixez les lamelles sur des lames de microscope à l’aide d’un milieu de montage anti-décoloration de 7 μL. Laissez le support de montage durcir pendant la nuit avant de sceller la lamelle sur la lame de microscope à l’aide de vernis à ongles.
7. Imagez les macrophages par microscopie confocale. Ex/Em pour FAM-YVAD-FMK est de 492/520nm et 642/661 pour la coloration d’acide nucléique fluorescente rouge lointain. Assurez-vous de régler le microscope de manière à ce que les cellules non traitées ne présentent aucune coloration de fond dans le canal 488. Sinon, la coloration de fond FAM-YVAD-FMK sera détectée et non la caspase-1 active réelle.

5. Imagerie des macrophages marqués par microscopie confocale

REMARQUE : Les cellules colorées peuvent être visualisées après que les lamelles ont durci pendant la nuit et ont été scellées sur la lame de microscope avec du vernis à ongles. Ici, l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal est décrite. Les cellules peuvent également être observées par microscopie à fluorescence standard.

1. Placez la lame avec les cellules de contrôle non traitées sur la platine du microscope et concentrez le microscope sur les cellules.
2. À l’aide des paramètres de la table de recherche du microscope (LUT), ajustez le décalage de sorte qu’il n’y ait pas de coloration FAM-YVAD-FMK positive dans les cellules non traitées. Ce processus peut également être effectué à l’aide de macrophages déficients en caspase-1.
   note: Le décalage doit être ajusté pour chaque canal utilisé dans l’expérience, mais le réglage du décalage correct est le plus critique pour le canal FAM-YVAD-FMK et les canaux d’anticorps fluorescents. Le décalage pour le canal ADN est moins critique. Une fois le décalage défini, ne l’ajustez pas pour le reste de l’expérience.
3. Passez la lame à l’échantillon traité à la nigéricine. Trouvez un champ qui contient à la fois des cellules positives et négatives pour la coloration FAM-YVAD-FMK. Ajustez le plan d’imagerie du canal FAM-YVAD-FMK sur le plan qui présente l’intensité de coloration positive la plus élevée. Il s’agit normalement du plan où le centre du foyer de l’inflammasome est imagé.
4. Ajustez le gain de manière à ce que les foyers soient visibles dans les cellules qui ont des noyaux condensés. Après avoir réglé le gain et le décalage, conservez ces paramètres pour le reste de la session d’imagerie.
   note: Un moyen facile de déterminer si une cellule est pyroptotique est d’examiner la morphologie nucléaire. Les cellules avec la caspase-1 active ont des noyaux arrondis et condensés, tandis que les nucléoles sont visibles dans les cellules sans activation de la caspase-1 et la morphologie nucléaire est similaire à celle des cellules non traitées.
5. Collectez des images de 5 champs sélectionnés au hasard avec un grossissement total de 100X. Cela se traduira normalement par environ 40 cellules par image. Répétez ce processus pour chaque échantillon.
6. Comptez le nombre de cellules dans chaque image à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Comptez ensuite le nombre de cellules qui ont une coloration FAM-YVAD-FMK positive. Représenter le niveau d’activation de la caspase-1 en pourcentage de cellules FAM-YVAD-FMK positives.