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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Différenciation des macrophages dérivés de la moelle osseuse
- À l’aide d’un milieu de différenciation préchauffé (21 ml de DMEM-10 complet et 9 ml de milieu conditionné à des cellules L929, tel que décrit par Swanson et al.), placez les cellules de la moelle osseuse dans une boîte de Pétri de 15 cm non traitée par culture tissulaire (1,2-1,5 x 107 cellules). Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 7 jours. Ajouter 30 ml supplémentaires de milieu de différenciation dans la plaque le jour 3 ou 4,
note: Il est important de ne pas utiliser de plaques traitées pour la culture tissulaire, car les macrophages seront difficiles à détacher et à récolter.
- Pour recueillir les macrophages, laver la plaque avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 20 mL de PBS froid + 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Incuber la plaque à 4 °C pendant 10 min. Récoltez les cellules en pipetant le PBS + EDTA sur les cellules et en lavant la plaque avec 10 mL de PBS. Combinez les deux lavages dans deux tubes coniques de 15 ml.
- Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 10 min et remettez les cellules en suspension dans 10 ml de DMEM sans rouge de phénol + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamine + 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol + 5 % FBS (DMEM-5) et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur Coulter. Gardez les cellules sur de la glace pendant le comptage.
- Ensemencer les macrophages dans des plaques recouvertes de culture tissulaire à raison de 2 x 105 cellules/mL. Pour les expériences de microscopie, ensemencer 1 mL de cellules sur des lamelles dans des plaques à 24 puits. Pour les tests de libération de LDH, ensemencez 100 μL de cellules dans une plaque à 96 puits. Pour l’essai LDH, amorcer 9 puits (3 puits non traités, 3 puits avec des contrôles de lyse à 100 % et 3 puits pour le stimulus expérimental).
- Centrifugez la plaque de 96 puits pendant 5 minutes à 300 x g pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties dans le puits.
- Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C + 5 % de CO2 avant de commencer le processus d’amorçage.
2. Amorçage
- Remplacer le milieu par un milieu frais (DMEM-5) contenant 100 ng/mL de LPS (500 μL pour la plaque à 24 puits ou 50 μL pour la plaque à 96 puits).
note: Il existe une variété de variations structurelles dans le LPS, qui affectent la capacité à stimuler l’amorçage médié par TLR4. Le LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) est disponible auprès de plusieurs fournisseurs et est recommandé.
- Incuber la plaque pendant 3 h à 37 °C et 5 % de CO2.
3. Activation de l’inflammasome NLRP3 avec la nigéricine
- Retirez le milieu et remplacez-le par 290 μL de DMEM-5 contenant 5 μM de nigéricine et 5 mM de glycine. La glycine est ajoutée pour réduire la quantité de lyse cellulaire qui se produit lors de l’activation de la caspase-1. Incuber pendant 60 min à 37 °C et 5 % CO2. Utilisez à la fois des macrophages de type sauvage et des macrophages déficients en caspase-1 pour s’assurer que l’étiquetage observé est spécifique à la caspase-1.
- Après 60 min, retirez le milieu et lavez les cellules trois fois pendant 5 min chacune avec 1 mL de PBS froid.
4. Coloration des anticorps
NOTE : Pour marquer les cellules avec des anticorps pour détecter l’ASC, amorcer et exposer les cellules à la nigéricine identique à la section précédente. Le traitement ultérieur est le suivant :
- Lavez les cellules trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1 mL de PBS froid. Ajouter 250 μL de solution de fixation et de perméabilisation. Incuber les cellules sur de la glace et couvrir pendant 30 min.
- Lavez les macrophages trois fois pendant 5 minutes chacun avec 1 mL de tampon de lavage.
- Ajouter 250 μL d’anticorps primaire contre l’ASC dilué à 1:500 dans un tampon de lavage et incuber pendant 1 h sur de la glace. Incluez une lamelle qui ne reçoit aucun anticorps primaire, mais qui ne recevra que le secondaire. Cette lamelle sera utilisée lors de la configuration du microscope pour régler le décalage correct.
- Lavez les cellules trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1 mL de tampon de lavage.
- Ajouter 250 μL d’anticorps secondaires (colorant fluorescent conjugué chèvre-anti-souris) dilué 1:500 dans un tampon de lavage et incuber pendant 1 h sur de la glace. Ajouter 4 μL de colorant d’acide nucléique fluorescent rouge lointain de 0,2 mM pendant les 5 dernières minutes de cette incubation pour marquer les noyaux.
- Lavez les cellules 3 fois avec 1 mL de tampon de lavage à froid et montez les lamelles sur des lames de microscope à l’aide d’un milieu de montage anti-décoloration de 7 μL. Laissez le support de montage durcir pendant la nuit avant de sceller la lamelle sur la lame de microscope à l’aide d’un vernis à ongles transparent.
- Imagez les macrophages par microscopie confocale. Ex/Em pour l’anticorps secondaire est de 555/580 nm et de 642/661 pour la coloration à l’acide nucléique fluorescent rouge lointain.