Un test de libération de lactate déshydrogénase pour détecter la mort des macrophages après une exposition à la nigéricine

Résumé

Source : den Hartigh, A.B. et al., Détection de l’activation de l’inflammasome et de la mort cellulaire pyroptotique dans des macrophages murins dérivés de la moelle osseuse. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre le dosage de la lactate déshydrogénase pour détecter la mort des macrophages médiée par l’inflammasome. Les macrophages sont exposés au lipopolysaccharide pour l’amorçage, suivi d’une exposition à la nigéricine pour provoquer la mort cellulaire induite par l’inflammasome, qui est déterminée par le dosage de la lactate déshydrogénase.

Protocole

1. Dosage de la LDH

REMARQUE : Pour le test de libération de LDH, ensemencez les cellules dans une plaque à 96 puits. Ne retirez pas le milieu après l’amorçage.

1. Remplacer le milieu par un milieu frais (DMEM-5 : 10 mL de DMEM sans rouge de phénol + 5 mM d’HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamine + 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol + 5 % de FBS) contenant 100 ng/mL de LPS dans les puits contenant des cellules de macrophages adhérentes (500 μL pour les plaques à 24 puits ou 50 μL pour les plaques à 96 puits).
   note: Il existe une variété de variations structurelles dans le LPS, qui affectent la capacité à stimuler l’amorçage médié par TLR4. Le LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) est recommandé.
2. Incuber la plaque pendant 3 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Ajouter 50 μL de DMEM-5 contenant 10 μM de nigéricine dans les puits expérimentaux et 50 μL de DMEM-5 dans les puits de contrôle spontanés et à 100 % de lyse. Incuber pendant 60 min à 37 °C et 5 % CO₂.
4. Après 30 min, ajoutez 10 μL de tampon de lyse 10x dans les puits de contrôle de lyse à 100 % et ajoutez 10 μL de DMEM-5 dans les autres puits. Au cours de cette incubation, retirer 1 flacon de mélange de substrat (1,5 mL de substrat lyophilisé) et 1 aliquote de tampon de dosage (~12 mL) du congélateur et les laisser décongeler à l’abri de la lumière à la température ambiante.
   note: Le mélange de substrat contient un sel de tétrazolium (violet d’iodonitrotétrazolium), qui est converti en un produit de formazan rouge.
5. Après l’incubation totale de 60 min, centrifuger la plaque pendant 5 min à 500 x g à 10 °C. Transférer 50 μL du surnageant dans une plaque transparente à fond plat. Pendant ce temps, ajoutez 12 ml de tampon de dosage dans le flacon de mélange de substrat et incubez à température ambiante pendant 5 minutes avant de l’utiliser.
6. Ajouter 50 μL de substrat dans chaque puits et incuber pendant 30 min dans l’obscurité. Incluez des puits de taille moyenne uniquement pour les valeurs vides. Vérifiez la plaque après 15 minutes pour vous assurer que le signal ne dépassera pas la limite de détection du lecteur de plaques.
7. Après 30 min, ajouter 50 μL de solution d’arrêt (1 M d’acide acétique) et mesurer la DO₄₉₀ à l’aide d’un lecteur de plaques.
8. Calculez le pourcentage de lyse cellulaire à l’aide de la formule suivante :
   % de cytotoxicité = ((Expérimental - Spontané)/(Maximum - Spontané))×100
   Expérimental : cellules traitées à la nigéricine ; spontanée : cellules non traitées ; Maximum : cellules exposées au tampon de lyse.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cytotox96 Essai de cytotoxicité non radioactive	Fisher Scientific	PR-G1780	Comprend un mélange de substrat et un tampon de dosage ; Formulations exclusives. La solution d’arrêt est 1 M d’acide acétique
DMEM, glycémie élevée, pas de glutamine, pas de rouge de phénol	Invitrogen	31053028
PBS de Dulbecco, sans calcium, sans magnésium	Invitrogen	14190144
Sérum fœtal de bovin, qualifié, origine américaine	Invitrogen	26140079	Inactivé à la chaleur à 55°C pendant 50 min
gentamicine	Invitrogen	15750060
LPS ultra-pur de Salmonella minnesota R595 (Re)	Liste des produits biologiques	434
Lecteur de plaques Spectramax M3	Dispositifs moléculaires	5000414
L-Glutamine	Invitrogen	21051024