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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles, nationales et internationales en matière de bien-être humain et ont été examinées par le comité d’examen institutionnel local.
1. Isolement des neutrophiles sains
- Obtenez 20 ml de sang périphérique d’un donneur sain dans deux tubes de 10 ml recouverts d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
- Mettez 10 ml de sang dans un tube stérile de 50 ml et ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à 32,5 ml.
- Ajouter un gradient de densité (p. ex., Ficoll-amidotrizoaat) sous les cellules.
- Prenez jusqu’à 14 ml de gradient de densité à l’aide d’une pipette de 10 ml et d’un contrôleur de pipette.
- Placez la pipette au fond du tube de 50 ml.
- Retirez le contrôleur de pipette de la pipette, en laissant le gradient de densité s’écouler de la pipette par gravité jusqu’à ce que le maximum soit atteint par effet capillaire (1 à 2 ml seront restants), sans utiliser le moteur.
- Retirez la pipette en plaçant un pouce sur le dessus de la pipette, empêchant ainsi le gradient de densité de s’échapper lors du retrait de la pipette.
- Faites tourner les tubes pendant 20 min à 912 x g et à température ambiante (RT) sans accélération ni frein.
REMARQUE : Les globules rouges (GR) et les neutrophiles ont une densité élevée et se trouvent au fond du tube de 50 ml. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont séparées et au-dessus du gradient de densité sous la forme d’un anneau blanc. Le plasma dilué par PBS sera supérieur aux PBMC. Si nécessaire, les PBMC peuvent être isolés en transférant l’anneau blanc dans un nouveau tube de 50 mL avec des étapes de lavage supplémentaires avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Retirez d’abord avec précaution l’anneau blanc contenant les PBMC, puis le plasma dilué au PBS et enfin la couche de gradient de densité autant que possible.
- Pour isoler les neutrophiles du mélange neutrophiles/érythrocytes, lyser les érythrocytes avec de l’eau distillée froide et stérile.
- Prenez une bouteille d’eau distillée froide stérile et une fiole PBS concentrée 10x du réfrigérateur.
- Travaillez rapidement pour cette étape. Ajoutez 36 ml d’eau distillée stérile froide directement sur la pastille et mélangez une fois soigneusement. Ajouter 4 mL de 10x PBS après 20 s pour obtenir une solution isotonique. Mélangez une fois soigneusement.
- Essorage du tube pendant 5 min à 739 x g et 4 °C (pour l’élimination des globules rouges). Les neutrophiles seront dans la pastille blanche.
- Jetez soigneusement le surnageant. Effectuez à nouveau l’étape 1.6.2 et assurez-vous que la pastille est correctement suspendue.
- Essorage du tube pendant 5 min à 328 x g et 4 °C.
- Retirer délicatement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de PBS. Comptez les neutrophiles et gardez-les sur la glace.
REMARQUE : Le rendement attendu d'1 tube de sang (10 ml) est d’environ 15 à 75 millions de neutrophiles.
2. Marquage des neutrophiles par des cellules fluorescentes rouges
- Fabriquer une suspension de neutrophiles de 10 à 20 millions de neutrophiles dans 2 ml de PBS dans un tube de 15 ml.
- Préparez une solution de 2 mL de PBS avec 4 μL de liquéfiant de cellules fluorescentes rouges de 2 μM (voir le tableau des matériaux) dans un tube différent de 15 mL. Ajoutez-le doucement à la suspension de neutrophiles et mélangez soigneusement.
- Incuber dans l’obscurité pendant exactement 25 minutes à 37 °C pour marquer les neutrophiles avec le linker de cellules fluorescentes rouges.
- Indésactiver l’étiquetage en ajoutant un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) inactivé par la chaleur à RT jusqu’à 15 mL et mélanger une fois soigneusement. Assurez-vous que le granulé est soigneusement remis en suspension si un granulé s’est formé.
- Tube de rotation pendant 5 min à 328 x g et RT.
- Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol contenant 2 % de FBS et 10 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à RT. Compter les neutrophiles.
note: Une perte de cellules de 50 % peut se produire après le marquage des cellules fluorescentes rouges.
3. Induction de la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles
- Faire une suspension cellulaire de 0,42 x 106 cellules/mL dans un milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol contenant 2 % de FBS et 10 % de P/S.
- Ajouter 37 500 neutrophiles dans 90 μL par puits dans une plaque noire à fond plat de 96 puits.
- Ajouter 10 μL du stimulus choisi (par exemple, les sérums d’un patient) en trois exemplaires pour atteindre une concentration de 10 % dans le puits. Incluez toujours un témoin négatif (moyen) en trois exemplaires.
- Incuber à l’obscurité à 37 °C pendant la durée souhaitée, allant de 30 min à 2, 4 ou 6 h. Il est suggéré d’incuber pendant 4 heures.
- Calculez le volume nécessaire pour ajouter 25 μL de colorant d’ADN imperméable à 5 μM (voir le tableau des matériaux), pour atteindre une concentration finale de 1 μM dans le puits. Faire une prédilution si nécessaire, dans un milieu RPMI 1640 contenant 2 % de FBS et 10 % de P/S pour obtenir une concentration de 5 μM.
- Ajouter 25 μL de colorant d’ADN imperméable 5 μM 15 min avant la fin du temps d’incubation. Poursuivre l’incubation pendant 15 minutes supplémentaires à 37 °C dans l’obscurité.
- Retirez le surnageant (~125 μL) très soigneusement et rangez-le si nécessaire. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Restez dans l’obscurité et passez immédiatement à l’étape 4.
4. Visualisation des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) avec microscopie confocale d’immunofluorescence 3D à haut contenu et haute résolution
- Configurez les paramètres sur le microscope confocal d’immunofluorescence en cliquant sur le bouton Configuration de l’acquisition.
- Cliquez sur l’onglet Configurer.
- Sélectionnez l’objectif et la caméra. Choisissez l’objectif 10X Apo Lambda avec un mode d’acquisition d’un sténopé confocal de 60 μm.
- Cliquez sur Plaque et choisissez la plaque en plastique à 96 puits. Sélectionnez les sites à visiter et choisissez un nombre fixe de sites. Remplissez 3 colonnes et 3 rangées sans chevauchement (0 μm), qui couvrent un total de 45 % du puits.
- Cliquez sur Acquisition. Sélectionnez Activer la mise au point laser. Sélectionnez Acquérir la série Z/Série chronologique si nécessaire.
- Cliquez sur Mise au point automatique du site.
- Cliquez sur Focus sur le fond de la plaque | Décalé par l’épaisseur du fond. Pour le puits initial pour trouver l’échantillon, choisissez le premier puits acquis. Pour l’autofocus du site, choisissez tous les sites.
- Cliquez sur Longueurs d’onde.
- Pour le nombre de longueurs d’onde, choisissez 2. Pour le niveau d’affinement de correction de l’ombrage TL, choisissez 2.
- Pour Longueur d’onde 1, sélectionnez Texas Red.
- Pour les options de mise au point automatique, sélectionnez un laser avec décalage Z, post-décalage laser de 1,1 μm. Utilisez Z-stack avec une plage personnalisée de 200-10.
- Pour Longueur d’onde 2, sélectionnez l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
- Pour les options de mise au point automatique, sélectionnez un laser avec un décalage Z de w1 0 μm. Utilisez Z-stack avec une plage personnalisée de 200-10.
- Pour les options d’acquisition, sélectionnez la série Z et l’image de projection 2D maximum. Pour les options d’acquisition, sélectionnez Correction de l’ombrage | Off.
- Sélectionnez Série Z. Sélectionnez le nombre d’étapes : 10. Sélectionnez la taille du pas : 3 μm (la portée totale sera de 27 μm).
- Placez la plaque dans la microscopie confocale d’immunofluorescence.
- Cliquez sur l’onglet Exécuter.
- Remplissez le nom et la description de la plaque et choisissez l’emplacement de stockage.
- Sélectionnez les puits qui doivent être acquis.
- Choisissez le temps d’exposition pour Texas Red et FITC.
- Cliquez sur Acquérir la plaque pour commencer l’acquisition, qui prendra environ 1 h par plaque.
5. Analyse de la formation des réseaux
- Utiliser un programme de traitement d’images conçu pour l’analyse d’images scientifiques multidimensionnelles (voir Table des matériaux) pour analyser la formation des NET.
- Transférez les données d’image acquises sur un disque dur séparé.
- Sélectionnez l’outil d’ajout de couleur.
- Sélectionnez w1 et choisissez le dossier du disque dur où les données sont stockées.
- Sélectionnez w2 et choisissez le dossier du disque dur où les données sont stockées.
note: Utilisez une macro standard qui utilise w1 dans le nom de fichier pour ajouter de la couleur rouge aux images Texas Red et utilise w2 pour ajouter de la couleur verte aux images FITC.
- Sélectionnez Macro d’analyse.
- Sélectionnez w1 et choisissez la valeur de seuil (seuil d’intensité), qui est généralement de 10. Sélectionnez la valeur de pixel souhaitée (seuil de taille, par exemple 100).
- Sélectionnez w2 et choisissez la valeur de seuil (seuil d’intensité), qui est généralement de 10. Sélectionnez la valeur de pixel souhaitée (seuil de taille, par exemple 500).
- Choisissez la destination du fichier de tableur, exécutez l’analyse et enregistrez les fichiers journaux par la suite.
- Analysez les données dans une feuille de calcul.