Isolement de lipides à partir de neutrophiles dérivés du sang humain par séparation biphasique

Résumé

Source : Brogden, G., et al. Méthodes pour étudier les altérations lipidiques dans les neutrophiles et la formation ultérieure de pièges extracellulaires à neutrophiles. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre l’isolement lipidique des neutrophiles humains par un système de solvant biphasique utilisant du méthanol et du chloroforme.

Protocole

1. Isolement des lipides et analyse des neutrophiles dérivés du sang humain

1. Prenez des neutrophiles et placez-les sur de la glace.
2. Sur la glace, pipeter les neutrophiles (présents dans une solution de méthanol et de chloroforme) dans un tube en verre à bouchon à vis de 15 ml avec un joint en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et homogénéiser en les agitant pendant 1 min. Utilisez des tubes en verre pour empêcher les lipides de se lier aux surfaces en plastique. Utilisez des capuchons en PTFE pour éviter la contamination par le caoutchouc/plastique.
3. Ajouter 2 mL de méthanol suivi 1 min plus tard de 1 mL de chloroforme. Agitez à nouveau pendant 1 min.
4. Faites pivoter les tubes de verre à RT et 50 tr/min pendant 30 min.
5. Granuler la fraction protéique en centrifugeant la solution à 7 °C et 1 952 x g pendant 10 min.
6. Décanter soigneusement le surnageant dans un nouveau tube en verre de 15 mL à bouchon à vis, en laissant la pastille contenant des protéines. Stockez la pastille à -20 °C pour une quantification future.
7. Ajouter 1 mL de chloroforme, attendre 1 min, ajouter 1 mL d’eau bidistillée et retourner le tube à vis en verre avec l’échantillon pendant 30 s.
8. Centrifuger à 7 °C et 1 952 x g pendant 10 min et jeter la phase supérieure, jusqu’à la couche trouble, mais sans l’inclusion.
9. Si nécessaire, effectuez une étape de purification supplémentaire facultative en répétant l’étape 1.1.8.
10. Sécher les échantillons dans un concentrateur sous vide à 60 °C et les stocker à -20 °C jusqu’à ce que nécessaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 10 μl	Hamilton	701 NR 10 μl
Canule 26G	Braun	4657683
chloroforme	Carl Roth	Référence 7331.1
méthanol	Carl Roth	N° 7342.1
Eau	Carl Roth	Référence 3255.1	Sans endotoxines