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1. Vérification de l’infection
REMARQUE : À l’aide d’un test de cytotoxicité, la compétence en matière d’infection peut être mesurée. Le protocole suivant mettra en évidence l’application d’un produit de cytotoxicité pour mesurer la libération de LDH (lactate déshydrogénase). D’autres produits de cytotoxicité peuvent également être utilisés
- Préparation de l’infection à C. neoformans des cellules macrophages
- Préparation de cellules fongiques
- À l’aide d’un stock de glycérol, strier la souche sauvage de C. neoformans (H99) sur une plaque gélosée de peptone dextrose (YPD) à base d’extrait de levure pour isoler des colonies uniques.
- Incuber toute la nuit pendant 16 h à 37 °C dans un incubateur statique.
- Sélectionner une seule colonie de souche sauvage de C. neoformans et la cultiver dans 5 mL de bouillon YPD dans un tube à essai de 10 mL légèrement bouché. Effectuer en quadruplicate.
- Incuber pendant une nuit de 16 h à 37 °C dans un incubateur à agitation à 200 tr/min.
- Le lendemain, les sous-cultures sont diluées à 1:100 dans 3 mL de bouillon YPD.
- Mesurer les valeurs de densité optique (OD600 nm) de la culture fongique pour déterminer la phase mi-log. Selon le spectrophotomètre, la souche sauvage de C. neoformans atteint la phase mi-logarithmique, généralement après une incubation de 6 à 8 heures en YPD avec des valeurs générales de DO600 nm allant de 1,0 à 1,5.
- Une fois que les cellules atteignent la phase mi-logarithmique, prélever une aliquote de 10 μL de suspension de cellules fongiques dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL et diluer 1:100 dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Prélevez et centrifugez les cellules à 1 500 x g pendant 10 min, lavez doucement la pastille avec du PBS stérile à température ambiante et répétez l’opération pour un total de trois lavages.
- Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture cellulaire exempt d’antibiotiques pour atteindre une concentration de 1,2 x 108 cellules/mL.
- Préparation de cellules macrophages
- Visualisez chaque puits dans la plaque à 6 puits pour vous assurer que les cellules ont atteint 70-80 % de confluence. Alternativement, les cellules peuvent être mesurées pour atteindre environ 1,2 x 106 cellules macrophages par puits.
- Milieu chaud supplémenté en antibiotiques à 37 °C avant le travail de culture cellulaire. S’assurer que l’environnement de travail est stérilisé avant les travaux de culture cellulaire. Visualisez les cellules à l’aide d’un microscope optique pour vous assurer qu’elles sont adhérentes et saines.
- Retirez le milieu de culture cellulaire de la boîte à l’aide d’une pipette sérologique ou d’un aspirateur sous vide.
- Ajouter délicatement 5 à 7 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile à température ambiante dans la boîte de 60 x 15 mm.
- Inclinez doucement le plat pour laver les cellules collées.
- Co-culture de cellules de C. neoformans et de macrophages
- Ajouter 1 mL de cellules de C. neoformans remises en suspension dans 4 puits contenant des cellules de macrophages.
note: Le nombre de plaques nécessaires devra être calculé avant de commencer l’expérience. Ajouter 1 mL de milieu sans antibiotiques pour vider les puits.
- Laisser les cellules incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 3 h.
- Retirer le milieu de culture cellulaire de la plaque à l’aide d’une pipette sérologique ou d’un aspirateur.
- Ajouter délicatement 1 mL de PBS stérile à température ambiante.
- Inclinez doucement la plaque pour laver les cellules extracellulaires de C. neoformans non attachées ou non phagocytées.
- Ajouter 1 mL de milieu sans antibiotiques dans chaque puits de la plaque à 6 puits.
- Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2.
- À des moments choisis (p. ex., 1, 3, 6, 12 et 24 heures), prélever le surnageant pour mesurer la libération de LDH conformément aux instructions du fabricant.
- Aux mêmes moments, les cellules macrophages non infectées seront lysées à une valeur déterminée pour une cytotoxicité maximale.
- Calculer la cytotoxicité comme suit :
