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1. Culture bactérienne
- Générer des souches mutantes isogéniques à utiliser pour l’étude du facteur sécrété spécifique d’intérêt.
note: Les souches de GAS (Streptococcus du groupe A) M1T1 5448 utilisées pour ces expériences comprenaient des GAS WT (de type sauvage), unmutant de chat sagAΔ déficient en SLS (sag = Streptolysin S associated gene, SLS = Streptolysin S) (abrégé dans le texte en ΔsagA), et une souche complétée par sagA (abrégée en texte en ΔsagA+sagA).
- Cultiver des souches de GAS M1T1 5448 dans 10 ml de bouillon Todd-Hewitt à 37 °C pendant 16 à 20 heures avant d’infecter les cellules humaines.
- Centrifuger les cultures bactériennes pendant la nuit (2 400 rcf pendant 10 min) et les remettre en suspension dans un milieu bactérien frais.
note: La remise en suspension dans le même volume que celui dans lequel les cultures d’une nuit ont été cultivées (5-10 ml) produit généralement une densité optique initiale souhaitable .
- Normaliser les cultures bactériennes à des concentrations de départ égales en diluant les cultures remises en suspension dans un milieu bactérien supplémentaire jusqu’à ce que la même densité optique à 600 nm (DO600) soit obtenue pour toutes les souches à tester (une DO600 d’environ 1,0 est recommandée pour plus de commodité).
note: Dans ces études, des cultures bactériennes en phase stationnaire ont été utilisées pour infecter les cellules hôtes immédiatement après la normalisation. Cependant, comme certaines souches de bactéries sortent de la phase stationnaire de manière non synchronisée, il peut être plus approprié de commencer les infections de l’hôte avec des cultures en phase logarithmique si cela s’avère être le cas pour les souches d’intérêt.
- Avant une analyse plus approfondie, effectuez un test de comptage des colonies pour déterminer les unités formant colonies (UFC) par millilitre présentes dans les cultures de départ afin de déterminer la multiplicité de l’infection (MOI), ou le rapport de bactéries par cellule hôte, puisse être déterminé.
- Préparez des dilutions en série de 1 ml de cultures bactériennes qui ont été normalisées à la densité optique souhaitée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou un milieu de croissance bactérienne approprié (le bouillon Todd-Hewitt a été utilisé dans ces études). Préparez des dilutions allant de 10-1 à 10-6 pour produire au moins un ensemble de plaques de gélose avec des colonies dénombrables (30-300 colonies). Effectuer toutes les dilutions en trois exemplaires.
- Transvaser 100 μl de chaque dilution en série sur une plaque de gélose contenant le milieu approprié pour l’espèce bactérienne analysée.
note: La gélose Todd-Hewitt a été utilisée dans ces études.
- À l’aide d’un épandeur bactérien en verre ou en plastique, répartissez uniformément la partie aliquote de 100 μl sur toute la surface de la plaque de gélose et continuez à étaler jusqu’à ce que le liquide soit absorbé dans la gélose. Effectuer sous la flamme en utilisant une technique stérile.
- Incuber les plaques de gélose à 37 °C pendant la nuit ou jusqu’à ce que des colonies dénombrables apparaissent.
- Comptez les colonies qui se développent sur chaque plaque et calculez l’UFC/ml dans la culture d’origine à l’aide de la formule suivante : nombre de colonies x inverse de la dilution/volume de culture en série en millilitres.
par exemple (200 colonies x dilution 1/10-5) / 0,1 ml plaqué = 2,0 x 108 UFC/ml.
2. Culture de cellules hôtes
- Obtenir une lignée cellulaire hôte appropriée pour les analyses souhaitées.
note: Les kératinocytes épithéliales humains HaCaT, un cadeau aimable de V. Nizet, ont été utilisés pour ces études.
- Conservez les cellules HaCaT dans des boîtes de culture de 100 mm dans le milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2.
3. Infection de la cellule hôte avec un système d’insertion de membrane perméable
- Placez les cellules dans des boîtes de culture tissulaire appropriées et laissez-les se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence.
note: Les cellules HaCaT utilisées dans ces études atteignent généralement la confluence dans les 2 à 3 jours suivant le placage.
- Pour la collecte de lysats (par exemple, l’analyse de signalisation et les tests de détermination de l’adénosine triphosphate (ATP)), placez des cellules HaCaT dans des boîtes à 6 puits à une densité d’ensemencement d’environ 3 x 105 cellules/puits.
- Pour les expériences d’imagerie par immunofluorescence, plaquez des cellules sur des lamelles en verre stérile dans des boîtes à 6 puits à une densité d’ensemencement d’environ 3 x 105 cellules/puits.
- Pour les tests de perméabilisation membranaire de l’homodimère d’éthidium et de libération de lactate déshydrogénase (LDH), placez les cellules HaCaT dans des boîtes de 24 puits à une densité d’ensemencement d’environ 5 x 104 cellules/puits.
- Immédiatement avant le traitement, lavez les cellules avec 1x PBS stérile.
- Appliquez du milieu de croissance frais sur les cellules. Dans les conditions décrites ici, appliquer 2 ml de milieu par puits pour les plaques à 6 puits ou 0,5 ml de milieu par puits pour les plaques à 24 puits. Si des traitements pharmacologiques sont testés, mélanger avec un milieu frais et appliquer lors de cette étape.
Remarque : Certains tests peuvent nécessiter d’autres milieux. Par exemple, comme le rouge de phénol et les concentrations sériques élevées interfèrent avec le test de libération de LDH, le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) sans rouge de phénol complété par 1 % d'albumine sérique bovine (BSA) (p/v), 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium a été utilisé pour ces expériences.
- Une fois le milieu frais appliqué, placez soigneusement une membrane perméable stérile de 0,4 m dans chaque puits. Effectuez cette étape dans une hotte à flux laminaire et utilisez des pinces stériles pour transférer l’insert de membrane perméable dans chaque puits.
- Appliquez du milieu de culture cellulaire frais dans la chambre supérieure de chaque puits selon les instructions du fabricant. Dans les conditions décrites ici, appliquer 1 ml de milieu par puits pour les plaques à 6 puits ou 0,1 ml de milieu par puits pour les plaques à 24 puits.
- Appliquer un volume approprié de cultures bactériennes normalisées (voir section 1) dans la chambre supérieure du système d’insertion à membrane perméable. Utilisez un milieu bactérien pour les traitements de contrôle non infectés. Pour obtenir les résultats décrits ici, ajoutez 25 μl de cultures normalisées par chambre pour des plaques à 24 puits et 100 μl de cultures par chambre pour des plaques à 6 puits.
Remarque : Dans ces études, des SGA de type sauvage ou mutants ont été appliqués à des cellules hôtes à un moment d’inertie de 10. Le MOI a été calculé sur la base du nombre final de cellules eucaryotes (par exemple, 2 x 106 cellules/puits), de sorte que 10 fois plus de bactéries ont été ajoutées par cellule hôte au début de la période d’infection (par exemple, 2 x 107 UFC par puits). Le MMŒ approprié variera selon les différentes espèces bactériennes et les analyses de suivi souhaitées.
note: En plus d’utiliser un milieu bactérien pour les témoins non infectés, d’autres contrôles utiles pour certaines applications de cette technique peuvent inclure des bactéries tuées par la chaleur ou un milieu bactérien épuisé à des fins de comparaison.
- Incuber les cellules infectées à 37 °C avec 5 % de CO2.
4. Collecte d’échantillons
- Pour prélever du milieu de culture cellulaire, des lysats de cellules hôtes ou des lamelles de verre contenant des cellules intactes pour des analyses de suivi, commencez par retirer soigneusement l’insert de membrane perméable à l’aide d’une pince stérile.
- Pour l’évaluation des protéines de l’hôte sécrétées :
- Prélever le fluide de la chambre inférieure dans des tubes de 1,5 ml. Évitez de déranger la monocouche pendant la collecte.
- Centrifuger les échantillons à 14 000 rcf pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
- Prélever la totalité du surnageant, à l’exception de 50 μl, dans un tube frais de 1,5 ml et le conserver à -20 °C ou l’utiliser immédiatement.