Détection de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes à l’aide de l’imagerie par fluorescence

Résumé

Source : Yang, J., et al. Détection automatisée et à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre le test d’adhérence bactérienne pour évaluer l’adhérence bactérienne marquée GFP à la culture de cellules épithéliales afin d’étudier la dynamique des interactions hôte-pathogène à l’aide de l’imagerie basée sur la microscopie à fluorescence.

Protocole

1. Adhérence bactérienne et coloration de la cellule hôte

1. Tout d’abord, lavez trois fois les monocouches de cellules A549 ensemencées avec du PBS 1x chaud. Pour chaque lavage, ajoutez 100 μL de 1x PBS dans chaque puits, pipetez doucement de haut en bas trois fois, jetez 1x PBS ou attendez 10 s après l’ajout, puis passez l’aspirateur pour retirer 1x PBS. Pour déterminer la cinétique de l’association bactérienne, superposez les cellules avec 100 μL de concentrations souhaitées de suspension bactérienne avec différents MOI (0, 1, 10 et 100). Faites tourner la bactérie à 200 x g pendant 10 min et incubez les cellules A549 infectées à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 1 h.
   supplémentaire note: Dans cette expérience, chaque condition avait un triple technique.
2. Éliminez les bactéries non liées en lavant les monocouches cinq fois avec du PBS chaud 1x comme décrit ci-dessus. Ajouter 100 μL de formaldéhyde à 4 % (dans 1x PBS) dans chaque puits des plaques à 96 puits pour fixer les cellules. Laissez les plaques reposer sur de la glace pendant 15 minutes, puis rincez la solution de fixation à l’aide de 1x PBS trois fois.
3. Pour colorer les noyaux, ajoutez 50 ng/mL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et incubez-le pendant 10 min à RT. Après l’incubation, lavez les puits trois fois avec 1x PBS. Couvrez les cellules A549 infectées avec 100 μL de 1x PBS pour éviter le dessèchement. Passez à l’étape suivante ou conservez la plaque à 4 °C jusqu’à 2 jours dans l’obscurité.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 fois par PBS	VWR	Référence 45001-130
4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Thermo Fisher	Référence 62248	Colorant de coloration de la cellule hôte
Plaque à 96 puits	Corning	Référence 3882	Puits d’une demi-surface, fond plat et transparent
Cellules A549	ATCC	CCL 185	Lignée cellulaire de mammifère
centrifugeuse	Eppendorf	5810R
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
Bouillon de soja typique	Cellules de croissance	Référence MBPE-4040
F-12k moyen	ATCC	302004	Milieu de culture cellulaire A549
Sérum fœtal bovin	Corning	35-016-CV