Une technique d’imagerie pour étudier la réponse calcique dans les cellules infectées par des bactéries

Résumé

Source : Smail, Y., et al. Imagerie des réponses Ca²⁺ lors de l’infection à Shigella des cellules épithéliales. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente une technique de détection de la réponse locale et globale des ions calcium lors de l’infection à Shigella des cellules épithéliales humaines. Shigella envahit les cellules hôtes et libère des effecteurs d’invasion, ce qui a un impact sur les niveaux de calcium intracellulaire. L’amplitude et la fréquence du calcium cytosolique local et global sont étudiées à l’aide d’un indicateur fluorescent.

Protocole

1. Préparatifs

1. Préparation des bactéries
   1. Placez les bactéries (souche de type sauvage Shigella exprimant l’adhésine AfaE (M90T-AfaE) sur une plaque de gélose trypticase de soja (TCS) contenant 0,01 % de rouge du Congo (CR) et incubez-les pendant 18 h à 37 °C
      note: Pour augmenter leur reproductibilité, les plaques de Shigella obtenues à l’étape 1.1.1 sont stockées à 4 °C et doivent être utilisées dans la semaine car toutes les colonies sur le milieu CR finiront par devenir rouges avec le temps.
   2. Inoculer le bouillon TCS avant la culture en pré-cueillant 3 colonies rouges dans les plaques striées.
      note: Une inoculation avec 3 colonies est réalisée pour limiter la probabilité de choisir un seul clone dont le plasmide de virulence a subi une recombinaison génétique.
   3. Cultivez des cultures bactériennes liquides dans un incubateur agitateur pendant 16 h à 37 °C à 200 tr/min. Ajouter de l’ampicilline à la concentration finale de 75 mg/mL. Les concentrations d’antibiotiques ne doivent pas dépasser 3 fois la concentration minimale inhibitrice, car un excès d’antibiotique peut entraîner la perte du plasmide de virulence.
      note: Le maintien du plasmide de virulence de Shigella doit être vérifié en plaçant les cultures bactériennes sur des plaques CR complétées par des concentrations appropriées d’antibiotiques. La présence de colonies blanches indique une perte de plasmide.
   4. Inoculer la culture TCS avec la pré-culture bactérienne à une dilution de 1:100. Incubez-le à 37 °C dans un incubateur agitateur pendant 2 h à 200 tr/min. Assurez-vous que la densité optique à 600 nm (OD_{600 nm}) est comprise entre 0,2 et 0,4.
   5. Centrifuger la culture bactérienne pendant 2 min à 13 000 x g à 21 °C et remettre la pastille en suspension dans un volume équivalent de milieu EM (120 mM de NaCl, 7 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl₂, 0,8 mM de MgCl₂, 5 mM de glucose et 25 mM d’HEPES, pH = 7,3).
   6. Diluez la suspension bactérienne dans un tampon EM à une DO finale de_{600 nm} de 0,1 et utilisez-la immédiatement ou stockez-la à 21 °C et utilisez-la dans les 60 minutes suivantes.
2. Préparation cellulaire
   1. Cultivez des cellules HeLa dans du DMEM avec 1 g/L de glucose complété par 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) et cultivez-les à 37 °C avec 10 % de CO₂. Cultivez du TC-7 cultivé dans du DMEM avec 4,5 g/L de glucose, contenant 10 % de FCS et d’acides aminés non essentiels dans un incubateur à 37 °C contenant 10 % de CO₂.
   2. Pour l’entretien des cellules, divisez régulièrement les cellules pour éviter une inhibition du contact de croissance liée aux états confluents, ce qui est essentiel pour une efficacité élevée de chargement/transfection de la sonde Ca²⁺.
   3. Placez les cellules HeLa sur des lamelles circulaires stériles de 25 mm de diamètre dans des plaques à 6 puits à une densité de 3 x 10⁵ cellules/puits la veille de l’expérience pour les cellules HeLa.
   4. Pour les cellules TC-7, trypsinisez et comptez les cellules. Semez-les à 4 x 10⁵ cellules/puits et incubez-les pendant 5 à 7 jours à 37 °C dans un incubateur à 10 % de CO₂ avant les expériences pour permettre la polarisation.
      1. Rafraîchissez le milieu de culture cellulaire tous les jours jusqu’au jour de l’expérience.
         note: Des chambres jetables à fond de verre de 35 mm de diamètre peuvent également être utilisées comme alternative aux puits contenant des lamelles. Si ces derniers sont utilisés, le contrôle de la température par une platine ou un objectif chauffé n’est pas suffisant, et une chambre d’incubation thermostatique montée sur la platine du microscope est nécessaire.
3. Le jour de l’expérience, retirer le milieu et laver les cellules 3 fois avec 1 mL de milieu EM à 21 °C.
4. Chargez les cellules avec 3 mM d’ester fluo-4/acétoxyméthyle (Fluo-4-AM) dans un tampon EM pendant 30 min à 21 °C.
   note: Alors que le chargement des cellules HeLa subconfluentes ne pose pas de problèmes majeurs, le chargement des cellules TC-7 polarisées est souvent hétérogène et peu efficace. Pour ces cellules, nous avons constaté que l’efficacité de charge est améliorée par l’ajout de l’agent dispersant – l’acide pluronique – à une concentration finale de 0,1 % et de l’inhibiteur du transporteur d’anions, la bromosulfophtaléine, à une concentration finale de 20 μM à l’EM contenant du Fluo-4-AM. L’utilisation de sondes chimiques ratiométriques ou de sondes FRET génétiquement codées nécessitant une double acquisition n’est pas compatible avec la vitesse d’acquisition requise pour l’imagerie des réponses locales en Ca²⁺.
5. Lavez les échantillons 3 fois avec un tampon EM et incubez-les davantage dans 1 mL de tampon EM à 21 °C pour permettre l’hydrolyse de la fraction AM. Utilisez les cellules chargées de Fluo-4 immédiatement ou dans les 90 minutes suivantes (maintenues à 21 °C).

2. Infection et acquisition d’images des réponses locales Ca²⁺

1. Placez la lamelle contenant les cellules chargées de Fluo-4 dans une chambre d’imagerie ou une chambre à fond de verre. Lavez les échantillons dans la chambre d’imagerie ou la chambre jetable à fond de verre 3 fois avec un tampon EM pour éliminer les composés pouvant résulter de la lyse cellulaire. Ajouter 1 mL de tampon EM.
2. Placez la chambre sur une platine de microscope à fluorescence inversée chauffée à 33 °C.
   note: Cette température est sélectionnée comme un compromis entre les températures optimales compatibles avec le processus d’invasion de Shigella et le ralentissement des réponses Ca²⁺ pour visualiser les réponses locales. Nous utilisons un objectif à huile d’immersion 63X (NA = 1,25) équipé de bagues à contraste de phase.
3. Sélectionnez une trame de microscopie et configurez les paramètres d’acquisition, y compris le temps d’exposition et le binning si nécessaire, pour optimiser le signal fluorescent Fluo-4.
   note: Les défis majeurs de l’imagerie locale Ca²⁺ sont la faible amplitude et la faible durée des réponses, nécessitant une acquisition au moins toutes les 30 ms. Plusieurs dispositifs à couplage de charge multiplicateurs d’électrons rétroéclairés (EM-CCD) ou caméras à semi-conducteurs à oxyde métallique complémentaire (C-MOS) disponibles dans le commerce présentent la sensibilité requise pour détecter les réponses locales en Ca²⁺ à l’aide de Fluo-4. La sensibilité de détection est également un enjeu important pour limiter les photodommages ou les artefacts tels que les réponses spontanées liées à l’excitation fluorescente de Fluo-4 à haute fréquence. Ici, un éclairage LED de 470 nm, avec un filtre d’excitation passe-bande de 480 ± 40 nm, un filtre dichroïque de 505 nm et une émission passe-bande de 527 ± 30 nm utilisée à 5 % de son intensité maximale combinée à un filtre de densité neutre de 1,0 a été utilisé pour minimiser ces problèmes dans un flux d’acquisitions de durées limitées. Une analyse des signaux locaux Ca²+ par lots de flux de 120 s a été effectuée en routine. Dans ces conditions de faible éclairage, le photoblanchiment des fluorophores n’a pas été observé pendant les acquisitions de 2 min-stream. Des acquisitions successives sur le même échantillon peuvent être effectuées, à condition d’utiliser des champs différents. En règle générale, un premier flux d’acquisition est effectué sur un champ témoin en l’absence de stimulation bactérienne pour s’assurer de l’absence de réponses spontanées. Si des réponses spontanées sont observées, les échantillons sont lavés avec un tampon EM jusqu’à ce qu’aucune réponse ne soit observée.
4. Pour ajouter des bactéries à l’échantillon, il faut retirer 500 μL de tampon EM de la chambre et ajouter 500 μL de la suspension bactérienne préparée à l’étape 1.1.6 pour obtenir une DO finale de_{600 nm} de 0,05, en prenant les précautions appropriées pour éviter de déplacer le champ de microscopie sélectionné ; les volumes assurent un bon mélange des bactéries et une distribution homogène des bactéries sur les échantillons de cellules.
5. Effectuez une acquisition lors de l’ajout de bactéries. Alternativement, effectuer une acquisition 10 min après l’ajout bactérien, ce qui correspond au temps nécessaire aux bactéries pour se sédimenter sur les cellules dans les conditions utilisées. À la fin du flux d’acquisition, acquérir une image en contraste de phase du champ sélectionné pour visualiser les bactéries en contact avec les cellules et les volants membranaires associés aux sites d’invasion bactérienne.
6. Répétez la procédure d’acquisition comme à l’étape 2.5, à des intervalles qui se prêtent à la durée des acquisitions d’images, à l’enregistrement des fichiers et à la sélection d’un nouveau champ pour couvrir l’ensemble du processus.
   Note : Pour Shigella, nous avons constaté que les flux d’acquisition toutes les 5 min pendant 20 min, suite à la sédimentation bactérienne de 10 min, permettaient de couvrir la majorité des événements d’invasion.
7. À la fin de la procédure d’acquisition, ajoutez une concentration finale de 2 μM des échantillons d’ionomycine ionophore Ca²⁺ pour déterminer l’amplitude maximale des signaux Ca²⁺. Acquérir des images toutes les 3 à 5 s jusqu’à la stabilisation du signal, généralement pendant moins de 10 minutes.
8. Poursuivez en ajoutant de l’éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N, N, N′, N′, acide N′-tétraacétique (EGTA) à une concentration finale de 10 mM pour déterminer le signal de fluorescence en l’absence de Ca²⁺. Acquisition d’images toutes les 3 à 5 s jusqu’à stabilisation du signal, généralement pendant moins de 10 min.
   note: En raison de la dynamique relativement lente des variations globales de Ca²⁺, effectuer ces acquisitions toutes les 3 à 5 s (pas en mode streaming), permettant d’obtenir une imagerie Ca²⁺ sur le même champ microscopique lors des traitements successifs.

3. Analyse

1. Exprimer les variations cytosoliques de Ca²⁺ au fil du temps sous la forme d’un pourcentage de ΔF/F0, où ΔF représente la variation de l’intensité de fluorescence moyenne de la région d’intérêt (ROI) et F0 la fluorescence de base dans le même ROI, à laquelle une région non pertinente du champ dépourvue de cellules est soustraite.
   1. Supprimer les niveaux de fluorescence basale pour chaque cellule dans différents champs, correspondant aux niveaux de base ; ces niveaux peuvent être déterminés sans ambiguïté en raison de la faible fréquence et de la durée relativement courte des réponses locales en Ca²⁺ dans une acquisition de flux donnée.
      Note : Quantifier les caractéristiques marquantes des réponses liées aux questions posées et au modèle pathogène étudié. Classiquement, divers paramètres sont pris en compte pour analyser les signaux Ca²⁺, notamment la fréquence des cellules montrant des réponses locales ou globales en Ca²⁺, ainsi que la durée, l’amplitude et la fréquence de ces réponses. Dans le cas de Shigella et des réponses locales, un autre aspect important de l’analyse est l’association spatiale des réponses avec les sites d’invasion bactérienne.
2. Pour quantifier le pourcentage de cellules réactives présentant des réponses globales ou locales, dessinez les ROI dans les cellules, en séries chronologiques correspondant aux variations d’intensité Fluo-4.
   1. Définissez des paramètres stricts pour identifier les réponses locales en Ca²⁺, telles qu’une amplitude trois fois supérieure aux variations de fond de l’intensité de fluorescence moyenne de la cellule de base, ou une durée d’au moins 200 ms, afin d’éviter d’obtenir un faux positif.
      note: En règle générale, même les petites réponses locales Ca²⁺ peuvent être distinguées de tout bruit de fond par leur profil. Les zones d’intérêt doivent être suffisamment grandes pour intégrer suffisamment de signaux de fluorescence pour permettre la détection des variations locales. Selon l’intensité de la détection Fluo-4, ces zones d’intérêt peuvent correspondre à des cercles d’un diamètre allant de 2 à 5 mM.
   2. Mesurez les variations de l’intensité moyenne de fluorescence Fluo-4 dans 2 régions d’une zone distincte de la même cellule, afin de déterminer si les réponses sont locales ou globales.
      note: L’analyse d’un grand nombre de cellules est facilitée par l’utilisation d’un logiciel d’imagerie permettant l’affichage à l’écran en ligne des variations de l’intensité moyenne de fluorescence dans le temps pour les régions sélectionnées. Les logiciels d’imagerie disponibles dans le commerce offrent une telle option, mais cela peut également être effectué à l’aide du logiciel gratuit Icy, en utilisant le plugin ROI Intensity Evolution.
   3. Déterminez le pourcentage de cellules affichant des réponses locales.
      note: Ce pourcentage est calculé à partir du nombre total de cellules analysées dans le domaine de la microscopie, qui doit être en nombre suffisant pour étayer une signification statistique à l’aide d’un test non paramétrique.
   4. Déterminez la durée des réponses locales.
      note: Les réponses locales de Ca²⁺ peuvent être distinguées en fonction de leur plage de durée (c’est-à-dire moins de 500 ms, entre 5 et 10 s, ou au-dessus de 10 s) et de leur association avec les sites d’invasion de Shigella.
3. Quantifiez l’amplitude des réponses. Tout d’abord, calibrez les niveaux maximaux de Ca²⁺ et le bruit de fond cellulaire déterminés à l’étape 2.1.7. Étant donné que la charge Fluo-4 peut varier pour chaque cellule, effectuez ces déterminations pour des cellules individuelles sur le terrain.
   1. Exprimer l’amplitude des réponses en pourcentage relatif de la réponse maximale.
   2. Effectuer des tests statistiques à l’aide d’un test de normalité, suivi d’un test paramétrique pour analyser les différences de potentiel dans l’amplitude des réponses entre les échantillons.
   3. Déterminer l’association de ces réponses par rapport aux sites d’invasion bactérienne par leur localisation respective aux volants membranaires induits par les bactéries visualisés dans les images de contraste de phase correspondantes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fluo-4 AM	Invitrogen	Réf. F14201
Version 7.7 de Metamorph	Imagerie universelle
Système d’éclairage CoolLED pE-2	Roper Scientific
Micro-plat 35 mm, haut	IBIDI	Référence 81156
Bouillon de Trypticase de Soja (TCS)	Thermopêcheur	Réf. B11768
gélose TCS	Thermopêcheur	Réf. B11043
Rouge Congo	Sigma-Aldrich	Référence 75768
M90T-AFAE	Sun et al., 2017		Shigella flexneri sérotype V. exprimant l’adhésine AfaE
ipgD-AfaE	Sun et al., 2017		Souche mutante isogénique ipgD exprimant l’adhésine AfaE