Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation des pan-leucocytes
- Prélever 1 mL de sang périphérique d’un donneur sain (ou d’un patient) dans une seringue héparinisée. Assurez-vous d’avoir l’approbation du comité d’éthique responsable pour le don de sang.
- Mélangez 1 mL de sang périphérique humain avec 30 mL de tampon de lyse ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 et 0,1 mM EDTA, pH 7,0) dans un tube de 50 mL et incubez pendant 8 min à température ambiante.
- Remplissez les tubes de PBS et centrifugez-les à 300 x g pendant 6 min. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 30 mL de tampon de lyse ACK.
- Répétez les étapes 1.2 et 1.3 jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Enfin, laver les cellules dans du PBS, centrifuger à 300 x g pendant 6 min à température ambiante et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de milieu de culture (RPMI1640 + 10 % de FCS). Incuber les cellules à 37 °C pendant 60 min.
2. Chargement des cellules Raji avec SEB
- Préparez deux tubes Falcon de 15 ml avec 1,5 x 106 cellules Raji par tube. Faites tourner les cellules (300 x g pendant 6 min à température ambiante) et jetez le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension dans un milieu résiduel (environ 50 à 100 μL), ajouter 1,9 μL (1,9 μG) de SEB et incuber à température ambiante pendant 15 min. Ajouter 5 mL de milieu de culture, faire tourner les cellules (300 x g pendant 6 min à température ambiante) et remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture (RPMI1640 + 10 % de FCS) à une densité de 1 x 106 cellules/mL.
3. Induction des synapses immunitaires et protocole de coloration
- Pipette de 500 μL de la préparation des cellules Raji chargées SEB dans un tube FACS et de 500 μL de la préparation des cellules Raji déchargées dans un autre tube FACS. Ajouter 650 μL de pan-leucocytes dans chaque tube et faire tourner les cellules (300 x g pendant 10 min à température ambiante). Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 150 μL de milieu de culture (RPMI1640 + 10 % de FCS). Incuber à 37 °C (généralement pendant 45 min).
- Agiter doucement les cellules (10 s à 1 000 tr/min) et ajouter 1,5 mL de paraformaldéhyde (1,5 %) pendant le vortex pour fixer les cellules. Arrêtez la fixation en ajoutant 1 mL de PBS + 1 % de BSA. Granulez les cellules (300 x g pendant 10 min à température ambiante et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de PBS + 1 % BSA après incubation à température ambiante pendant 10 min.
- Granuler (300 x g pendant 10 min à température ambiante) et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de PBS + 1 % BSA + 0,1 % de saponine pendant 15 min à température ambiante pour perméabiliser les cellules (plaque 96 puits, en forme de U).
- Laver les cellules dans du PBS + 1 % BSA + 0,1 % de saponine par centrifugation (300 x g pendant 10 min à température ambiante) et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 50 μL de PBS + 1 % BSA + 0,1 % de saponine contenant des anticorps ou des composés marqués au fluorophore (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) et DAPI (1:3 000)).
- Incuber les cellules à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min. Lavez les cellules 3 fois en ajoutant 1 mL de PBS + 1 % BSA + 0,1 % de saponine. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à température ambiante. Remettre les cellules en suspension dans 60 μL de PBS pour la cytométrie en flux d’imagerie.
4. Acquisition d’images à l’aide d’un cytomètre en flux
REMARQUE : La procédure d’acquisition d’images et l’analyse des données suivantes sont basées sur la cytométrie en flux d’imagerie à l’aide de logiciels tels que imagestream (IS100), INSPIRE et IDEAS. Cependant, d’autres cytomètres en flux et logiciels d’analyse peuvent également être utilisés.
- Ouvrez le logiciel d’analyse sur l’ordinateur connecté au cytomètre en flux d’imagerie et cliquez sur Initialiser la fluidique dans le menu Instrument. Appliquez les perles sur le port droit lorsque vous êtes invité à le faire.
- Chargez le modèle par défaut à partir du menu Fichier et cliquez sur Exécuter/Configurer. Choisissez Perles dans le menu déroulant Affichage.
- Réglez l’illuminateur à fond clair en cliquant sur Régler l’intensité si la valeur indiquée est inférieure à 200.
- Exécutez la routine d’étalonnage et de test dans l’onglet Assistance en cliquant sur Démarrer tout.
- Cliquez sur Flush/Lock/Load et appliquez les échantillons dans le port gauche lorsque vous y êtes invité. Après avoir chargé les cellules dans le cytomètre en flux, ouvrez le classificateur de cellules et ajustez les valeurs comme suit : limite supérieure d’intensité de crête à 1 022 pour chaque canal, limite inférieure d’intensité de crête à 50 pour le canal 2 (DAPI) et canal 5 (CD3-Pe-TxR), limite inférieure de zone à 50 pour le canal 1 (diffusion latérale) et limite supérieure à 1 500.
- Modifiez la puissance du laser d’excitation sur 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) et 647 nm (90 mW) dans l’onglet Configuration.
- Basculez le menu déroulant Affichage entre Cellules et Perles pour évaluer les réglages du classificateur de cellules et de la puissance laser.
note: Assurez-vous que toutes les cellules et tous les couples de cellules se trouvent dans la vue Cell et que les amas de cellules, les débris et les images avec des pixels saturés se trouvent dans la vue Debris en modifiant les classificateurs de cellules et/ou les puissances du laser d’excitation.
- Définissez le nom de l’échantillon et le nombre d’images à acquérir (15 000 à 25 000 pour les échantillons et 500 pour les commandes de compensation) dans l’onglet Setup. Cliquez sur Run/Setup pour lancer l’acquisition.
