Introduction de protéines effectrices bactériennes dans des cellules de mammifères par électroporation

Résumé

Source : Sontag, R. L. et al., Électroporation d’effecteurs bactériens fonctionnels dans des cellules de mammifères. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’introduction de protéines effectrices bactériennes dans des cellules de mammifères par électroporation. La localisation intracellulaire des protéines effectrices bactériennes est détectée par microscopie confocale après coloration avec des anticorps spécifiques conjugués aux fluorophores.

Protocole

1. Électroporation

1. Placez 400 μl de suspension cellulaire dans une cuvette pré-refroidie et ajoutez 20 μg de protéines sélectionnées dans la cuvette (50 μg/ml).
2. Agissez doucement la cuvette ~10 fois pour mélanger sans endommager les cellules. note: La cuvette peut également être inversée plusieurs fois pour bien mélanger, mais ne la pipette pas de haut en bas ou de vortex pour éviter d’endommager les cellules.
3. Séchez l’extérieur de la cuvette avec une serviette en papier ou un autre essuie-glace pour éviter les arcs électriques dans l’électroporateur.
4. Échantillon d’électroporate à 0,3 kV pendant 1,5 à 1,7 ms. Remarque : C’était typique de cette étude.
5. Immédiatement après l’électroporation, agitez doucement la cuvette ~10 fois pour bien mélanger.

2. Placage des cellules

1. Stockez la cuvette avec les cellules électroporatives sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être placée dans des plaques de récupération.
2. Pour la plupart des analyses en aval, laver les cellules 1x avec du NGM préchauffé pour éliminer la protéine effectrice étrangère.
   1. Retirer les cellules pour analyse et les suspendre dans 3 à 5 ml de NGM.
   2. Cellules de granulés par centrifugation à 900 x g pendant 4 min.
   3. Remettre en suspension dans un volume adéquat de NGM pour la taille de plaque souhaitée (par exemple, 2 ml pour une boîte de 35 mm).
3. Retirez le nombre approprié de cellules pour l’analyse en aval.
   1. Exemple 1 : Plaque dans des boîtes à fond de verre pour l’analyse microscopique.
   2. Exemple 2 : Plaque dans du plastique de culture cellulaire pour l’analyse de protéines telles que les purifications d’affinité.
4. Laisser les cellules se rétablir en plaques équilibrées dans une atmosphère humidifiée à 95 % d’air/5 % de CO₂ à 37 °C pendant au moins 4 heures.

3. Analyse microscopique

1. Fixation/coloration par immunofluorescence
   1. Lavez les cellules 1x avec du PBS stérile après une période de récupération de 4 heures.
   2. Fixez les cellules dans du méthanol à 100 % pendant 2 min à température ambiante. Utilisez suffisamment de méthanol pour couvrir complètement les cellules (par exemple 2 ml pour une parabole de 35 mm).
   3. Laver 3 fois avec du PBS stérile.
   4. Perméabiliser les cellules avec 0,4 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min. Par exemple, utilisez 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre.
      1. Ajustez la longueur de perméabilisation et la force de Triton X-100 en fonction de l’épitope et de l’emplacement de la protéine cible. note: Les meilleurs résultats devront être déterminés empiriquement pour chaque cible, cependant, les conditions ci-dessus devraient être adéquates pour la plupart des cibles cytosoliques.
   5. Bloc avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans PBS pendant 1 heure à RT. Par exemple, utilisez 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre.
   6. Laver 3 fois avec du PBS.
   7. Incuber l’anticorps primaire dans une solution de liaison d’anticorps (0,1 % de Triton X-100 et 1 % de BSA dans du PBS) pendant la nuit à 4 °C en le balançant doucement. Par exemple, utilisez 0,5 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre.
      1. Suivez les recommandations du fabricant pour la dilution des anticorps. note: Par exemple, l’anticorps SBP-tag a été utilisé à une dilution de 1:1 000, tandis que l’anticorps PKN1 a été utilisé à une dilution de 1:200.
   8. Laver 4 fois avec du PBS.
   9. Incuber avec l’anticorps secondaire conjugué fluorescent approprié dans une solution de liaison d’anticorps pendant 1 heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.
      1. Par exemple, utilisez Alexa 488 ou Alexa 647 pendant 1 heure à température ambiante.
         1. Suivez les recommandations du fabricant pour la dilution des anticorps. (p. ex., environ 1:1 000 pour cette étude).
      2. Ajoutez d'autres colorants au besoin, par exemple, 5 μM d'agglutinine de germe de blé (WGA) conjuguée à Alexa 647 ou DAPI selon les recommandations du fabricant, pendant 1 heure à température ambiante.
   10. Laver 5 fois avec du PBS et conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’au moment de prendre des images.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de trypsine-EDTA à 0,25 %	Cellgro	Référence 25-050-CL
Cuvettes d’électroporation jetables de 0,4 cm	Bio-Rad	Référence 165-2088
100 % méthanol	quelconque	n/a	Inflammable, toxique
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	N° A4919
Appareil de comptage cellulaire - hémocytomètre ou compteur de socs	Beckman Coulter	Modèle Z1
Incubateur de culture cellulaire	quelconque	n/a	Atmosphère humidifiée à 95 % d’air et 5 % de CO2 à 37 °C
Culture cellulaire plastique	quelconque	n/a	Fioles/plaques de culture cellulaire, pipettes, tubes, gendarme en caoutchouc
Modification du médium d'Eagle par Dulbecco (DMEM)	Cellgro	Référence 10-013	Chaud à 37 °C
Électroporateur	Bio-Rad	Émetteur d’E. coli
Sérum fœtal bovin (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Microscope confocal fluorescent	Ziess	Modèle LSM 710
Plats à fond en verre pour la microscopie	Wilco Wells	HBSt-3522
Lignée cellulaire HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
Média essentiel minimal (MEM)	Cellgro	Référence 10-010	Chaud à 37 °C
Autres colorants fluorescents (WGA, DAPI) en conjonction avec un réactif anti-décoloration	quelconque	n/a
Pénicilline/streptomycine	Cellgro	30-002-CL
Lignée cellulaire RAW 264.7	ATCC	TIB-71
Anticorps primaire contre la cible d’intérêt	quelconque	n/a
Anticorps secondaire conjugué à un fluorophore	quelconque	n/a
Saline tamponnée au phosphate	quelconque	n/a	Réfrigérer à 4 °C
Saline stérile tamponnée au phosphate	quelconque	n/a	Chaud à 37 °C
Centrifugeuse de table capable d’accepter des tubes coniques (godet oscillant de préférence)	quelconque	n/a
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Réf. T8585	Irritant, Toxique