Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Culture de Malassezia en laboratoire
REMARQUE : Conservez tous les réactifs et milieux utilisés pour ce protocole à température ambiante (RT, 20 – 25 °C), sauf indication contraire, car une température plus basse peut inhiber la croissance fongique.
- Préparez le milieu Dixon modifié sous forme liquide (mDixon) pour la croissance de Malassezia. Pour préparer 500 ml de milieu mDixon liquide, dissoudre 18 g d’extrait de malt, 10 g de bile de bœuf desséchée, 5 ml de Tween-40, 3 g de peptone, 1 ml de glycérol et 1 ml d’acide oléique dans 500 ml de H2O distillé (dH2O). Ajustez le milieu à pH 6 avec HCl et autoclave. Stockez le support à RT.
- Préparez des plaques de gélose mDixon en ajoutant 7,5 g de gélose à 500 mL de milieu mDixon avant l’autoclavage. Refroidir lentement la gélose mDixon après l’autoclave à l’aide d’une barre de direction et d’une plaque chauffante magnétique pour éviter la solidification partielle du fluide pendant le refroidissement.
- Une fois que la gélose a refroidi à 50 – 60 °C, versez le liquide dans des boîtes de Pétri dans une hotte à flux laminaire et laissez-les sécher à RT pendant la nuit.
note: Les plaques de gélose peuvent être conservées à 4 °C pendant plusieurs semaines lorsqu’elles sont emballées et conservées à l’envers pour éviter l’évaporation.
- Obtenez des isolats de Malassezia et faites revivre les stocks lyophilisés de Malassezia selon les instructions obtenues par le fournisseur.
- Inoculer 10 mL de milieu mDixon liquide dans un erlenmeyer stérile de 100 mL avec la suspension de Malassezia ressuscitée selon les instructions obtenues par le prestataire. Incuber la culture dans un incubateur à agitation à 30 °C et 180 tr/min.
- Inspectez régulièrement la croissance de la culture Malassezia en vérifiant l’apparence de la couleur crème et de la turbidité. La cinétique de croissance dépend de l’espèce et de la souche de Malassezia et peut être particulièrement lente lorsque Malassezia est fraîchement ressuscité à partir d’une souche lyophilisée. (Figure 1A).
- Préparez des stocks de glycérol en mélangeant 3 parties de la culture de Malassezia densément cultivée dans un milieu mDixon avec 1 partie de glycérol stérile à 99 %. Aliquote le mélange Malassezia/glycérol dans des tubes stériles à bouchon à vis et conserver à -80 °C.
- Pour la multiplication in vitro, mettre en boîte Malassezia de la culture liquide dans mDixon ou du stock de glycérol congelé sur une plaque de gélose mDixon (amenée à RT à partir de 4 °C) à l’aide d’une boucle d’inoculation.
note: Transférer les plaques de gélose mDixon sur RT à partir de 4 °C avant l’utilisation, car la gélose mDixon froide inhibe la croissance fongique.
- Incuber la ou les plaques de gélose avec Malassezia à l’envers dans un incubateur N (sans agitation) à 30 °C. Inspectez régulièrement la croissance des colonies de Malassezia.
REMARQUE : Les colonies de Malassezia sur des plaques de gélose mDixon apparaissent en 3 à 5 jours et sont de couleur crème, ternes et lisses avec une élévation convexe (figure 1B).
- Conservez les colonies de Malassezia sur des plaques de gélose mDixon à RT pendant ~ 2 semaines. Par la suite, préparez une nouvelle plaque de gélose mDixon en striant Malassezia du stock de glycérol congelé comme décrit au point 1.7.
2. Préparation de l’inoculum pour l’infection expérimentale à Malassezia de souris
- Inoculer 10 mL de milieu mDixon liquide dans un erlenmeyer stérile de 100 mL avec 3 à 5 colonies individuelles de Malassezia à partir d’une plaque de gélose mDixon (voir l’étape 1, figure 1B).
- Incuber la culture de Malassezia pendant ~ 48 à 96 h à 30 °C et 180 tr/min jusqu’à ce que la culture soit de couleur crème et trouble (Figure 1A).
note: Le temps nécessaire à la croissance de Malassezia dépend de l’espèce et de la souche de Malassezia et de la quantité de champignon utilisée pour l’inoculation.
- Transvaser 2 ml de la culture de Malassezia dans un tube de microcentrifugation stérile de 2 ml et centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g.
- Jeter le surnageant et laver la pastille en la suspendant dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifugez à nouveau pendant 1 min à 10 000 x g.
- Après le lavage, suspendre la pastille dans 1 mL de PBS par pipetage vigoureux et mesurer la densité optique de la solution à 600 nm (ODA600) à l’aide d’un spectromètre. Diluez la suspension Malassezia 20 à 50 fois avec du PBS pour la mesure de la DO afin de vous assurer que la lecture est comprise entre 0,1 et 1,
note: La densité d’une culture de Malassezia de 3 jours varie généralement entre 15 et 30 ODA600, en fonction de l’espèce et de la souche de Malassezia et du nombre de cellules de levure utilisées pour l’inoculation de la culture (étape 2.1). Malassezia a tendance à former des agrégats, par conséquent, un pipetage vigoureux est nécessaire pour assurer l’homogénéité de la suspension.
- Aliquote un volume de la suspension de Malassezia dans du PBS qui correspond à une densité de 4 ODA600 dans un tube stérile de 2 mL. Préparez 1 tube par animal à infecter.
- Centrifuger les tubes contenant Malassezia pendant 1 min à 10 000 x g.
- Jeter le surnageant et suspendre la pastille de Malassezia dans 200 μL d’huile d’olive indigène (correspondant à 2 cellules de levureOD A600/100 μl d’huile d’olive).
note: L’huile d’olive s’est avérée être un bon véhicule pour l’infection épicutanée par Malassezia, car Malassezia est une levure lipophile et dépendante des lipides. L’huile d’olive est mieux absorbée par la peau que le PBS. Cependant, sachez qu’il n’est pas facile de suspendre la Malassezia dans l’huile d’olive. Améliorer la suspension de Malassezia/huile d’olive par vortexing. Maintenez la suspension à RT jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour l’infection.
- Préparez des tubes avec de l’huile d’olive seule pour simuler l’infection des animaux témoins.
3. Infecter des souris avec Malassezia
- Commandez des souris C57BL/6 femelles à l’âge de 6 à 8 semaines et laissez-les s’acclimater dans l’animalerie expérimentale pendant au moins une semaine. Calculez pour 3 à 5 souris par groupe, y compris un groupe témoin non infecté.
- Préparez un cocktail anesthésique stérile contenant 1,3 mg/mL de xylazine et 6,5 mg/mL de kétamine dans du PBS. 5 mL du cocktail anesthésique suffisent pour anesthésier 20 animaux. Ajustez le volume du cocktail en fonction du nombre d’animaux à anesthésier.
- Anesthésier les animaux en injectant 10 μL/g de poids corporel de cocktail anesthésique par voie intrapéritonéale (correspondant à 65 mg de kétamine et 13 mg de xylazine par kg de poids corporel) et placer les animaux anesthésiés sur un coussin chauffant à 37 °C.
note: À la dose indiquée, les animaux restent généralement anesthésiés pendant ~ 30 à 60 min.
- Vérifiez les réflexes en pinçant le pied arrière avec une pince pour vous assurer que les animaux sont bien anesthésiés.
- Appliquez une crème pour les yeux sur les yeux pour prévenir la déshydratation pendant l’anesthésie.
- En option, mesurez l’épaisseur des deux oreilles à l’aide d’un pied à coulisse (plage de 0 à 5 mm). Mesurez deux zones différentes de chaque oreille et calculez l’épaisseur moyenne de l’oreille par oreille.
note: La mesure de l’épaisseur de l’oreille est facultative et dépend de la question de recherche. Cependant, si l’épaisseur de l’oreille est utilisée comme indicateur d’inflammation cutanée, il est nécessaire de mesurer l’épaisseur de base de l’oreille avant l’infection. (voir étape 4).
- En option, perturbez la barrière épidermique de la peau de l’oreille dorsale en décapage léger du ruban adhésif : appliquez manuellement un petit morceau de ruban adhésif sur la peau et retirez-le à nouveau. Répétez l’opération pendant 5 tours consécutifs à l’aide d’un nouveau morceau de ruban adhésif pour chaque tour.
REMARQUE : Malassezia induit une inflammation cutanée plus prononcée dans les peaux perturbées par rapport aux peaux non perturbées (Figure 2A).
- Appliquer localement 100 μL (2 ODA600) de la suspension Malassezia/huile d’olive sur la face dorsale de chaque oreille à l’aide d’une pipette stérile. Inclure un groupe témoin d’animaux traités uniquement avec de l’huile d’olive (groupe témoin traité par véhicule).
note: Vaporisez vigoureusement la suspension de Malassezia/huile d’olive pour assurer une suspension homogène de Malassezia immédiatement avant l’application.
- Laissez les animaux anesthésiés sur le coussin chauffant pour éviter l’hypothermie jusqu’à ce qu’ils montrent des signes de récupération (mouvement des moustaches, augmentation du rythme respiratoire, etc.).
- Injecter 200 μL de solution de glucose à 2 % stérile et préchauffée par voie sous-cutanée dans le pli nucal pour soutenir leur métabolisme et leur réhydratation.
note: Pour préparer une solution de glucose stérile à 2 %, dissolvez 1 mg de glucose dans 50 mL de PBS et filtrez-le à l’aide d’un filtre de 0,2 μm. La solution peut être conservée à 4 °C.
- Transférez les animaux dans leur cage.
4. Analyse de l’inflammation cutanée induite par Malassezia
REMARQUE : Cette procédure décrit l’analyse du gonflement de l’oreille induit par Malassezia pendant l’infection qui sert de paramètre de l’inflammation cutanée. Une condition préalable à l’analyse du gonflement de l’oreille induit par le champignon est de mesurer l’épaisseur de base de l’oreille avant le décapage et/ou l’infection (étape 3.5).
- Préparez la chambre d’isoflurane pour l’anesthésie à court terme des animaux infectés par Malassezia et des animaux témoins.
- Transférez un animal à la fois dans la chambre et attendez que l’animal soit complètement anesthésié.
note: Les signes d’une anesthésie appropriée comprennent une relaxation corporelle complète ainsi qu’une respiration lente et lourde (flanc). Surveillez attentivement l’anesthésie car une exposition prolongée à l’isoflurane peut être mortelle.
- Retirez l’animal de la chambre et placez-le sur un mouchoir.
- Mesurez l’épaisseur de l’oreille à l’aide d’un pied à coulisse (plage de 0 à 5 mm). Mesurez deux zones différentes de chaque oreille et calculez l’épaisseur moyenne par oreille (voir étape 3.5).
- Transférez l’animal dans la cage.
note: L’anesthésie à l’isoflurane est de très courte durée et les animaux se rétablissent en ~ 30 s après leur retrait de la chambre d’isoflurane.
- Calculez l’augmentation de l’épaisseur de l’oreille en soustrayant l’épaisseur moyenne de l’oreille de base, mesurée avant le décapage de la bande et/ou l’infection, de l’épaisseur moyenne de l’oreille mesurée à chaque point après l’infection.
- Tracez les valeurs calculées en fonction de l’augmentation de l’épaisseur de l’épi ou, alternativement, de l’épaisseur totale de l’épi au fil du temps pour chaque animal ou groupe d’animaux (figure 2B).
5. Analyse de la charge fongique dans la peau infectée
- Préparez un tube de microcentrifugation stérile de 2 mL pour chaque épi à prélever, contenant 0,5 mL de nonidet P40 stérile à 0,05 % (NP40) en dH2O et une bille d’acier autoclavée (5 mm de diamètre).
- Pesez les tubes à l’aide d’une balance de précision et notez le poids précis.
- Euthanasier les souris par asphyxie au CO2.
- Retirer l’épi à la base et transvaser dans le tube contenant 0,5 mL de NP40 stérile à 0,05 % dans dH2O, comme décrit aux étapes 5.1 et 5.2.
- Pesez le tube contenant le tissu de l’oreille et calculez le poids réel de chaque échantillon en soustrayant le poids du tube sans l’organe du poids du tube avec l’organe.
- Homogénéiser le tissu de l’oreille pendant 6 min à 25 Hz à l’aide d’un homogénéisateur de tissus. Assurez-vous que le tissu est bien homogénéisé.
- Déposer 100 μL de chaque échantillon (correspondant à 1/5 de chaque homogénat, facteur de dilution = 5) sur des plaques de gélose mDixon et incuber les plaques à l’envers dans un incubateur à 30 °C.
note: La quantité d’homogénat plaquée doit être ajustée en fonction de la charge fongique à prévoir. Assurez-vous d’avoir suffisamment d’homogénat pour obtenir au moins 10 et pas plus de 250 colonies par plaque afin de permettre un dénombrement facile. En option, plaquez plusieurs plaques par échantillon avec différentes dilutions d’homogénat.
- Inspectez régulièrement la croissance des colonies de Malassezia.
note: Les colonies deviennent généralement visibles après 2 à 3 jours. Le temps nécessaire à la croissance des colonies de Malassezia dépend de l’espèce et de la souche de Malassezia.
- Comptez les colonies par plaque.
- Calculez le nombre d’unités formant colonies, UFC/g de tissu à l’aide de la formule suivante :
UFC/g de tissu = (nombre de colonies/plaque) x (facteur de dilution) / (poids de l’échantillon de peau en g).
note: La limite minimale de détection approximative peut être évaluée à l’aide de la formule suivante : limite minimale de détection = (1 colonie/plaque) x (facteur de dilution) / (poids moyen de tous les échantillons de peau en g).
- Les charges fongiques sont généralement tracées sur une échelle logarithmique (figure 2C).
