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1. Infection par Mtb de cellules dérivées de monocytes
REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une installation BSL-3.
- Remettre en suspension la pastille de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) dans un milieu RPMI sans sérum dans un nouveau tube stérile de 50 mL et ajuster la concentration bactérienne finale à environ 5 x 106 UFC/mL.
- Retirez le milieu de culture cellulaire de la ou des plaques à 6 puits contenant des cellules dérivées de monocytes. Ajouter 1 mL de milieu RPMI sans sérum dans chaque puits. Ajouter 1 mL de suspension bactérienne par puits pour obtenir une multiplicité d’infection (MOI) 5:1, c’est-à-dire 5 x 106 UFC pour 106 macrophages dans 2 mL/puits et incuber les plaques pendant 4 h à 37 °C et 5 % de CO2.
- Après l’infection, laver les cellules 3 fois avec 1 ml de tampon de lavage stérile pour éliminer les bactéries extracellulaires. Inclinez la plaque et retirez soigneusement tout le tampon de lavage des coins. Remettre en suspension les cellules dérivées de monocytes infectées par Mtb dans 2 mL de milieu complet RPMI sans antibiotiques et procéder à la coloration par cytométrie en flux ou incuber les cellules pendant 24 heures supplémentaires (ou à d’autres points temporels) avant la cytométrie en flux.