Un test pour étudier le rôle de la vitronectine dans l’adhésion bactérienne aux cellules épithéliales de l’hôte

Résumé

Source : Singh, B. et al., Assays for Study the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’un test pour étudier le rôle de la vitronectine dans l’adhésion d’Haemophilus influenzae aux cellules épithéliales de l’hôte.

Protocole

1. Etude de l’adhérence dépendante de Vn des bactéries aux cellules épithéliales

1. Cultiver des cellules A549 (cellules épithéliales alvéolaires de type II) dans une fiole de culture tissulaire de 75 cm² avec un milieu F12 complété par 10 % (vol/vol) de sérum de veau fœtal (FCS) (milieu complet) et 5 μg/mL de gentamicine. Incuber le ballon dans un incubateur avec 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 3 jours jusqu’à ce qu’il soit confluent à 80 % (la confluence peut être estimée en visualisant la couverture de surface par les cellules à l’aide d’un microscope inversé). Les quatre étapes suivantes décrivent comment préparer les cellules épithéliales pour le test.
   1. Laver la monocouche cellulaire dans le ballon deux fois avec 20 mL de PBS en l’agitant doucement. Pour détacher les cellules de la surface du ballon, ajoutez 2 ml de solution enzymatique de détachement cellulaire et incubez le ballon pendant 5 min à 37 °C. Tapotez le ballon avec votre paume pour détacher toutes les cellules de la surface en plastique. Pipetez de haut en bas plusieurs fois pour disperser les amas de cellules.
   2. Ajouter 18 mL de milieu complet F12 dans la fiole et transférer la suspension cellulaire entière dans un tube Falcon stérile de 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g à RT et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu complet F12.
   3. Retirez 10 μL de la suspension cellulaire et placez-la dans un tube Eppendorf, puis ajoutez 90 μL de solution de bleu de trypan. Chargez l’échantillon dans un hémocytomètre (profondeur 0,1 mm) après avoir placé la lamelle.
   4. Comptez toutes les cellules viables dans les zones A, B, C et D (chaque champ se compose de 16 carrés et chaque carré a une aire de 0,0025 mm²), puis calculez le nombre moyen de cellules ([A+B+C+D]/4). Calculez le nombre de cellules par millilitre à l’aide de l’équation suivante :
      Cellules viables/mL = numération cellulaire moyenne ×^{10 4} × facteur de dilution.
      note: Ici, le facteur de dilution est de 10.
   5. Diluer la suspension cellulaire à 5,0 x 10³ cellules/mL à l’aide d’un milieu complet contenant 5 μg/mL de gentamicine. Distribuer 500 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Incuber la plaque à 37 °C dans 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.
2. Avant l’infection bactérienne, retirer le milieu des puits et ajouter le milieu F12 (sans SCA), puis incuber toute la nuit à 37 °C.
3. Lavez la monocouche cellulaire trois fois avec 500 μL de PBS à RT. Placez la plaque sur de la glace et ajoutez 100 μL de milieu F12 pré-refroidi contenant 10 μg/mL de Vn. Incuber la plaque à 4 °C pendant 1 h. Pour les puits de contrôle, ajoutez uniquement du milieu F12.
4. Après l’incubation, jeter la solution par pipetage et laver la couche cellulaire deux fois avec 1 mL de PBS à RT.
5. Culture d’isolats cliniques Hif dans un milieu de perfusion cerveau-cœur (BHI) complété par 10 μg/mL de NAD et d’hémine à 37 °C avec agitation à 200 tr/min. Utilisez le milieu Luria-Bertani pour cultiver E. coli. Récolter Hif à mi-logarithmie (OD600 = 0,3) et remettre les bactéries en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2, contenant 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) (tampon bloquant ; PBS-BSA). Réglez la suspension à 10⁹ UFC/mL. Remettre en suspension une culture de Hif M10 fraîchement cultivé dans un milieu F12 (2×10⁸ UFC/mL). Ajouter 100 μL de cette suspension bactérienne dans chaque puits et incuber la plaque pendant 2 h à 37 °C.
   note: Chaque puits contient environ 2 x 10⁵ cellules A549. Pour l’infection, 2 x 10⁷ UFC bactériennes ont été ajoutées, ce qui correspond à une multiplicité d’infection de 100.
6. Retirez le milieu par pipetage et lavez trois fois les cellules épithéliales A549 avec du PBS. Ajouter 50 μL/puits de solution de détachement cellulaire et incuber la plaque pendant 5 min à 37 °C.
7. Ensuite, ajoutez 50 μL de milieu complet F12 par puits pour arrêter la réaction enzymatique. Transférez les cellules épithéliales (≈100 μL [c.-à-d. le volume entier]) de chaque puits dans un tube de verre de 6 mL contenant quatre billes de verre. Lyser les cellules à RT en tourbillonnant pendant 2 min.
8. Diluez 10 μL de lysat cellulaire 100 fois en ajoutant 10 μL de lysat à 990 μL de milieu F12. Déposer 10 μL de l’échantillon dilué sur une plaque de gélose au chocolat.
9. Incuber la plaque de gélose au chocolat à 37 °C pendant la nuit, puis compter les colonies. Chaque colonie représente une UFC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à fond rond en polystyrène de 5 mL	BD Faucon	Référence 60819-138	12 × 75 mm
Incubateur alimenté à 5 % de CO2	Thermo Scientific	BBD6220
Tube à fond rond en polystyrène de 6 mL	VWR	Référence 89000-478	12 × 75 mm avec capuchon
Plaques à 24 puits	BD Faucon	Référence 08-772-1H	Qualité de culture cellulaire
Fiole de culture tissulaire de75 cm 2	BD Faucon	BD353136	Ventilé
A549 Lignée cellulaire humaine	Sigma-Aldrich	Référence 86012804-1VL
Enzyme de décollement cellulaire (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	Qualité de culture cellulaire
Albumines sériques bovines (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Convient pour la culture cellulaire
F12 moyen	Sigma-Aldrich	D6421	Qualité de culture cellulaire
Sérum de veau fœtal (FCS)	Sigma-Aldrich	12003C	Convient pour la culture cellulaire
Hémocytomètre	Marienfeld	Référence 640210
Fiole de culture tissulaire	BD Faucon	3175167	75 cm2
Vitronectine (Vn) à partir de plasma humain	Sigma-Aldrich	Réf. V8379-50UG	Qualité de culture cellulaire